ムスカリンM5受容体は、ヒト脳微小血管内皮細胞におけるアセチルコリン誘発Ca2+シグナルと一酸化窒素放出を引き起こす

基底前脳ニューロンは、アセチルコリン（ACh）を放出することにより脳血流（CBF）を制御します。これは、内皮筋肉症受容体に結合して、副甲状腺内の原因と血管拡張を誘導します。それにもかかわらず、AChがヒト脳微小血管内皮細胞を刺激してNOを生成するメカニズムはまだ不明です。ここでは、ACHがヒト脳微小血管内皮細胞の広範なモデルであるHCMEC/D3細胞でCa2+依存的にNO産生を刺激するかどうかを評価しようとしました。ACHは、M5ムスカリン受容体（M5-MACHRS）の遺伝的遮断によって防止された細胞内Ca2+濃度（[Ca2+] I）の用量依存性の増加を誘導しました。/D3セル。包括的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析により、3型イノシトール-1,4,5-三リン酸受容体（INSP3 R3）、2ポアチャネル1および2（TPC1-2）、STIM2、ORAI1の転写産物の発現が明らかになりました。-3。薬理学的操作により、AChに対するCa2+反応は、Insp3 R3、TPC1-2、およびストア操作Ca2+エントリ（SOCE）によって媒介されることが示されました。ACH誘発性NO放出は、M5-MACHRを欠く細胞で阻害されました。同様に、ACHは、選択的NOS阻害剤であるL-NAME、または膜周期の細胞内Ca2+バッファーであるBaptaの存在下でNOレベルを上げることができませんでした。さらに、ACHに対するCa2+応答の薬理学的遮断も、付随するNO産生を阻害しました。これらのデータは、ACHがシナプスで放出されたACHが、M5-MACHRSを介してCa2+シグナルを刺激することにより、ヒト脳微小血管内皮細胞でNO放出をトリガーする可能性があることを初めて示しています。

Basal forebrain neurons control cerebral blood flow (CBF) by releasing acetylcholine (Ach), which binds to endothelial muscarinic receptors to induce nitric (NO) release and vasodilation in intraparenchymal arterioles. Nevertheless, the mechanism whereby Ach stimulates human brain microvascular endothelial cells to produce NO is still unknown. Herein, we sought to assess whether Ach stimulates NO production in a Ca2+ -dependent manner in hCMEC/D3 cells, a widespread model of human brain microvascular endothelial cells. Ach induced a dose-dependent increase in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+ ]i ) that was prevented by the genetic blockade of M5 muscarinic receptors (M5-mAchRs), which was the only mAchR isoform coupled to phospholipase Cβ (PLCβ) present in hCMEC/D3 cells. A comprehensive real-time polymerase chain reaction analysis revealed the expression of the transcripts encoding for type 3 inositol-1,4,5-trisphosphate receptors (InsP3 R3), two-pore channels 1 and 2 (TPC1-2), Stim2, Orai1-3. Pharmacological manipulation showed that the Ca2+ response to Ach was mediated by InsP3 R3, TPC1-2, and store-operated Ca2+ entry (SOCE). Ach-induced NO release, in turn, was inhibited in cells deficient of M5-mAchRs. Likewise, Ach failed to increase NO levels in the presence of l-NAME, a selective NOS inhibitor, or BAPTA, a membrane-permeant intracellular Ca2+ buffer. Moreover, the pharmacological blockade of the Ca2+ response to Ach also inhibited the accompanying NO production. These data demonstrate for the first time that synaptically released Ach may trigger NO release in human brain microvascular endothelial cells by stimulating a Ca2+ signal via M5-mAchRs.