肺炎連鎖球菌の従来およびリアルタイムのPCRベースの血清型のためのマルチターゲットプラスミドコントロール

背景：肺炎連鎖球菌の血清型は、疾患監視の不可欠な部分であり、従来の血清型を使用してこれまでに92を超える血清型が特徴づけられています。血清型を引き起こす最も主要な疾患を特定するために、従来のマルチプレックスPCR（それぞれCMPCRとRMPCR）のように、分子血清型視法がますます使用されています。CMPCRは41のターゲットにまたがる8つの反応で構成されており、RMPCRは7つのトリプレックス反応で構成されていることを考えると、これらのアッセイのポジティブコントロールを標準化することは困難です。そのため、CMPCR（PSPN-CM1）用の43ターゲットプラスミドとRMPCRの23ターゲットプラスミド（PSPN-RM1）が設計および検証されました。 方法：プラスミドPSPN-RM1は、CMPCRのすべてのPCRターゲットプライマー結合部位配列を含むキメラDNA配列として設計および合成されました。プラスミドPSPN-RM1は、RMPCRに必要なすべてのプライマーおよびプローブ配列で構成されていました。追加の標的（LytaとCPSA）は、Escherichia coliからの伝播と精製に続いて、定量化のために両方のプラスミドに含まれていました。 結果：CMPCR反応を使用してテストすると、すべてのターゲットをテンプレートとしてPSPN-CM1を使用して再現性に検出できます。RMPCR反応の場合、すべてのターゲットは、1.1（±0.2）×104コピー/mlのPSPN-RM1の濃度で再現性に補充され、各ターゲットのPCR効率は代表的なS.肺炎血清型から抽出されたDNAに相当しました。 結論：これらの定量化可能な多ターゲットプラスミドは、S。pneumoniaeのPCRベースの血清タイピングのコントロールの調製を簡素化し、本明細書の方法は他の高度に多重化されたPCRアッセイに拡張できます。

BACKGROUND: Serotyping of Streptococcus pneumoniae is an integral part of disease surveillance, with over 92 serotypes characterized to date using traditional serotyping. To identify the most predominant disease causing serotypes, molecular serotyping methods are now increasingly being used, like conventional and real-time multiplex PCR (cmPCR and rmPCR, respectively). Given that cmPCR consists of eight reactions spanning 41 targets, and rmPCR consists of seven triplex reactions, standardizing positive controls for these assays is challenging. As such, a 43-target plasmid for cmPCR (pSpn-CM1) and a 23 target plasmid for rmPCR (pSpn-RM1) were designed and validated. METHODS: Plasmid pSpn-RM1 was designed and synthesized as chimeric DNA sequences to include all PCR target primer binding sites sequences for cmPCR. Plasmid pSpn-RM1 consisted of all primer and probe sequences required for rmPCR. Additional targets (lytA and cpsA) were included in both plasmids for quantification, following their propagation and purification from Escherichia coli. RESULTS: When tested using the cmPCR reactions, all targets could be reproducibly be detected using pSpn-CM1 as template, with good amplicon visibility at a concentration of 1.4 (± 0.3) × 105 copies/ml was used. For the rmPCR reactions, all targets were reproducibly amplified with a concentration of 1.1 (± 0.2) × 104 copies/ml of pSpn-RM1, and the PCR efficiency for each target was equivalent to DNA extracted from representative S. pneumoniae serotypes. CONCLUSIONS: These quantifiable multi-target plasmids simplify the preparation of controls for PCR-based serotyping of S. pneumoniae, and methods herein could be extended to other highly multiplexed PCR assays.