単一ターンオーバープロテアーゼPCSK9のタンパク質分解を評価するためのハイスループットルシフェラーゼアッセイ

プロタンパク質コンバーターゼサブチリシン/ケキシン9型（PCSK9）は、血清低密度リポタンパク質（LDL）レベルを調節し、その結果、心血管疾患を調節する一本ターンオーバープロテアーゼです。PCSK9タンパク質分解はその完全なコレステロール血症効果に必要ですが、そのタンパク質分解機能の評価は困難です。PCSK9はそれ自体を切断することが知られていることが知られており、単一の離職のみを受け、タンパク質分解後、自動阻害剤としての活性部位でその基質を保持します。。ここに示されている方法は、これらの課題を克服するアッセイを説明しています。このアッセイは、細胞ベースのコンテキストでの分子間タンパク質分解に焦点を当て、分泌されたルシフェラーゼ活性に成功した切断を結び付けます。突然変異誘発、一時的なトランスフェクション、ルシフェラーゼの読み取りの連続的なステップを介して、アッセイは、高スループットの方法で遺伝的または分子摂動のいずれかの条件下でPCSK9タンパク質分解をプローブできます。このシステムは、臨床的に発見されたミスセンス単一ヌクレオチド多型（SNP）の生化学的評価と、PCSK9タンパク質分解の小分子阻害剤のスクリーニングの両方に適しています。

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.