ミトコンドリア由来ROS活性化AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を間接的に活性化する

ミトコンドリア反応性酸素種（ROS）産生は、オルガネラから細胞に情報を伝達する厳密に調節されたレドックス信号です。ATPなどの他のミトコンドリアシグナルは、主要な代謝センサーとレギュレーター、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を含む酵素によって感知されます。AMPKは、ミトコンドリアATP産生を需要に合わせて一致させることにより、細胞ATP/AMPおよびATP/ADP比に応答します。以前の報告では、AMPKαサブユニット上の酸化還元感受性システイン残基（CYS-299/CYS-304）に作用するROSによって、AMPK活性もROSに反応することを提案しました。これは、アデニンヌクレオチド依存性メカニズムと酸化還元シグナルの両方によって、ミトコンドリアがAMPK活性を微調整する魅力的なモデルを示唆しています。ここでは、ROSの生理学的レベルがAMPK活性を直接変化させるかどうかを評価しました。この目的のために、私たちは細胞に外因性の過酸化水素（H2O2）を追加し、ミトコンドリアを標的とした酸化還元サイクラーミトパラックを利用して、酸化的リン酸化を混乱させることなくミトコンドリア内でROSを生成しました。ミトコンドリアおよびサイトゾルチオール酸化は、ペルオキシレドキシンの二量体化を測定し、レドックス感受性蛍光タンパク質を測定することにより評価されました。AMPKα1の推定酸化還元アクティブシステイン残基をアラニンに置き換えると、AMPK活性の測定と並行してAMPKの応答がH2O2に対する反応を変えませんでした。細胞ATP/ADP比を測定しました。これにより、ROS生産によるAMPK活性への影響を、この比率の変化によって引き起こされるものから分離することができました。酸化還元の変化に応じたAMPK活性は、AMPK自体に対する直接的な作用によるものではなく、ミトコンドリアATP生産などの他のプロセスに対するレドックス効果の二次的な結果であると結論付けています。

Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production is a tightly regulated redox signal that transmits information from the organelle to the cell. Other mitochondrial signals, such as ATP, are sensed by enzymes, including the key metabolic sensor and regulator, AMP-activated protein kinase (AMPK). AMPK responds to the cellular ATP/AMP and ATP/ADP ratios by matching mitochondrial ATP production to demand. Previous reports proposed that AMPK activity also responds to ROS, by ROS acting on redox-sensitive cysteine residues (Cys-299/Cys-304) on the AMPK α subunit. This suggests an appealing model in which mitochondria fine-tune AMPK activity by both adenine nucleotide-dependent mechanisms and by redox signals. Here we assessed whether physiological levels of ROS directly alter AMPK activity. To this end we added exogenous hydrogen peroxide (H2O2) to cells and utilized the mitochondria-targeted redox cycler MitoParaquat to generate ROS within mitochondria without disrupting oxidative phosphorylation. Mitochondrial and cytosolic thiol oxidation was assessed by measuring peroxiredoxin dimerization and by redox-sensitive fluorescent proteins. Replacing the putative redox-active cysteine residues on AMPK α1 with alanines did not alter the response of AMPK to H2O2 In parallel with measurements of AMPK activity, we measured the cell ATP/ADP ratio. This allowed us to separate the effects on AMPK activity due to ROS production from those caused by changes in this ratio. We conclude that AMPK activity in response to redox changes is not due to direct action on AMPK itself, but is a secondary consequence of redox effects on other processes, such as mitochondrial ATP production.