Na+、K+-AtPase（α1β1）上の心臓グリコシドの結合動態と阻害効力の再検討：方法論的考慮事項

はじめに：OuabainとDigoxinは、Na+、K+-AtPaseの古典的な阻害剤です。治療剤または実験ツールとしての従来の使用に加えて、内因性ホルモンである可能性があることを示唆する証拠により、新たな関心があります。やや驚くべきことに、異なる出版物は、特に遅い結合阻害剤、ウアベイン、ジゴキシンのNa+、K+-ATPase活性（IC50）を阻害するための効力に大きな矛盾を示しています。 方法：精製したブタ腎臓Na+、K+-ATPase（α1β1FXYD2）および精製洗剤可溶性組換えヒトNa+、K+-ATPase（α1β1FXYD1）を使用して、結合および阻害動態と阻害動態と阻害速度論、およびアバン、アワバガニンのアババガニンのK+濃度の効果を再評価しました。ジゴキシゲニン。 結果：ゆっくりした結合阻害剤、ウアベイン、ジゴキシンの場合、効力の過小評価を避け、阻害を正しく決定するために、長いインキュベーション時間（37°Cで60分以上）が必要であることを明確に示しています（5mmで100-200NM前後のIC50K+）ATPのない薬物の事前インキュベーションの後に短いインキュベーション時間が続く場合に反対。対照的に、急速に結合した阻害剤、ウアバゲニンとジゴキシゲニンの場合、短いインキュベーション時間で十分です（<10分）。高生理学的K+濃度（≥5mm）で観察される抑制効力の強力な低下も、一部の著者によって報告された低い効力を説明しました。 議論：データは、準最適なアッセイ条件に起因する文献の矛盾を解決します。同様のIC50値は、ブタ腎臓および組換えヒトNa+、K+-ATPaseについて得られます。これは、抑制力がNa+、k+-の種の違い（pig対ヒト）または環境（膜結合対洗剤可溶性）によって決定されないことを示しています。atpase。現在の方法論的な考慮事項は、ゆっくりした結合阻害剤の薬物開発に特に関連しています。

INTRODUCTION: Ouabain and digoxin are classical inhibitors of the Na+,K+-ATPase. In addition to their conventional uses as therapeutic agents or experimental tools there is renewed interest due to evidence suggesting they could be endogenous hormones. Somewhat surprisingly, different publications show large discrepancies in potency for inhibiting Na+,K+-ATPase activity (IC50), particularly for the slow binding inhibitors, ouabain and digoxin. METHODS: Using purified pig kidney Na+,K+-ATPase (α1β1FXYD2) and purified detergent-soluble recombinant human Na+,K+-ATPase (α1β1FXYD1) we have re-evaluated binding and inhibition kinetics and effects of K+ concentration for ouabain, digoxin, ouabagenin and digoxigenin. RESULTS: We demonstrate unequivocally that for slow binding inhibitors, ouabain and digoxin, long incubation times (≥60 min at 37 °C) are required to avoid under-estimation of potency and correctly determine inhibition (IC50 around 100-200 nM at 5 mM K+) contrary to what occurs when pre-incubation of the drugs without ATP is followed by a short incubation time. By contrast, for the rapidly bound inhibitors, ouabagenin and digoxigenin, short incubation times suffice (<10 min). The strong reduction of inhibitory potency observed at high un-physiological K+ concentrations (≥5 mM) also explained the low potency reported by some authors. DISCUSSION: The data resolve discrepancies in the literature attributable to sub-optimal assay conditions. Similar IC50 values are obtained for pig kidney and recombinant human Na+,K+-ATPase, showing that inhibitory potencies are not determined by the species difference (pig versus human) or environment (membrane-bound versus detergent-soluble) of the Na+,K+-ATPase. The present methodological considerations are especially relevant for drug development of slow binding inhibitors.