高次元の質量細胞測定のための金属アイソトープタグ付きモノクローナル抗体

単一細胞質量細胞測定の進歩により、免疫細胞の不均一性の高次元の特性評価がますます改善されました。イムノアッセイの多重化能力は、安定した重金属同位体で標識されたモノクローナル抗体に依存しています。これまで、さまざまな希土類元素と高貴な移動後の金属同位体が質量サイトメトリーで使用されています。それにもかかわらず、抗体の共役に使用される方法は、個々の金属調整化学とさまざまな金属陽イオンの明確な安定性のために異なります。ここでは、48の高純度の重金属同位体でモノクローナルIgG抗体を共役させるための3つの最適化されたプロトコルを提供します：（i）38ランタニドの同位体、インジウム2本の同位体、およびユートリウムの1同位体。（ii）6個のパラジウムの同位体。（iii）1ビスマスの同位体。モノマーDOTA（1,4,7,10-テトラザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）または高分子ペンテティック酸（DTPA）の協調リガンドを含む二機能性キレート剤（DTPA）を使用して、病気の解像度で安定して隔離されたアイソトピック症であり、その後、部位固有の二go gonal反応を使用してIgG抗体に結合しました。さらに、280 nmでの抗体固有の吸収と、ビシンコニン酸（BCA）で染色した後の562 nmでの外因性吸収に基づく定量化方法が、金属アイソトープタグ付き抗体を決定することが報告されています。さらに、パラジウム同位体質量タグを調製するための凍結乾燥手順について説明します。ユーティリティを実証するために、飛行時間（Cytof）による細胞測定における生きた免疫細胞のバーコーディングアッセイのための6つのパラジウムタグ付きCD45抗体を使用した実験について説明します。ランタニド、インジウム、またはイトリウムの純粋な同位体の結合には約3.5時間かかります。ビスマスの共役には約4時間かかります。パラジウムの質量タグの準備には〜8時間かかります。パラジウムの純粋な同位体の活用には約2.5時間かかります。抗体滴定には約4時間かかります。

Advances in single-cell mass cytometry have increasingly improved highly multidimensional characterization of immune cell heterogeneity. The immunoassay multiplexing capacity relies on monoclonal antibodies labeled with stable heavy-metal isotopes. To date, a variety of rare-earth elements and noble and post-transition metal isotopes have been used in mass cytometry; nevertheless, the methods used for antibody conjugation differ because of the individual metal coordination chemistries and distinct stabilities of various metal cations. Herein, we provide three optimized protocols for conjugating monoclonal IgG antibodies with 48 high-purity heavy-metal isotopes: (i) 38 isotopes of lanthanides, 2 isotopes of indium, and 1 isotope of yttrium; (ii) 6 isotopes of palladium; and (iii) 1 isotope of bismuth. Bifunctional chelating agents containing coordinative ligands of monomeric DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) or polymeric pentetic acid (DTPA) were used to stably sequester isotopic cations in aqueous solutions and were subsequently coupled to IgG antibodies using site-specific biorthogonal reactions. Furthermore, quantification methods based on antibody inherent absorption at 280 nm and on extrinsic absorption at 562 nm after staining with bicinchoninic acid (BCA) are reported to determine metal-isotope-tagged antibodies. In addition, a freeze-drying procedure to prepare palladium isotopic mass tags is described. To demonstrate the utility, experiments using six palladium-tagged CD45 antibodies for barcoding assays of live immune cells in cytometry by time-of-flight (CyTOF) are described. Conjugation of pure isotopes of lanthanides, indium, or yttrium takes ~3.5 h. Conjugation of bismuth takes ~4 h. Preparation of palladium mass tags takes ~8 h. Conjugation of pure isotopes of palladium takes ~2.5 h. Antibody titration takes ~4 h.