インスリン受容体/キナーゼのジチオトレイトール活性化は、ネイティブアルファ2ベータ2インスリン受容体サブユニット複合体のサブユニット解離を伴わない

ジチオトレイトール（DTT）活性化インスリン受容体/キナーゼのサブユニット組成は、硫酸ナトリウム（SDS） - ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルろ過クロマトグラフィー（0.1％SDS）または非発生（0.1％Triton X-100）条件下でのゲルろ過クロマトグラフィーによって検査されました。。50 mM DTTによる32p標識インスリン受容体の前処理に続いて、0.1％SDSでゲルろ過クロマトグラフィーが続いたことにより、アルファ2ベータ2インスリン受容体複合体（MR 400,000）のモノマー95,000ベータサブユニットへの解離が示されました。対照的に、1〜50 mM DTTでインスリン受容体を前処理した後に、0.1％Triton X-100でゲルろ過クロマトグラフィーを前処理しても、未処理のインスリン受容体と比較して可動性の明らかな変化はありませんでした。非還元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによるこの複合体の解像度は、アルファベータヘテロダイマーまたは遊離モノマーベータサブユニットの種が存在するアルファ2ベータ2ヘテロテトラマリック複合体の存在を実証しました。これは、ゲルろ過クロマトグラフィーによるDTTの除去後、インスリン受容体がMR 400,000複合体に再酸化できることを示唆しています。驚くべきことに、これらの明らかに再酸化されたインスリン受容体は、インスリンとベータサブユニットの自己リン酸化のインスリン刺激に対する親和性が50％減少しているにもかかわらず、インスリン結合に関して機能的であることが観察されました。再酸化を防ぐために、インスリン受容体を50 mM DTTで前処理した後、0.1％Triton X-100のゲルろ過クロマトグラフィーの前に、過剰なN-エチルマレイミドとのインキュベーションを行いました。これらの条件下で、インスリン受容体はMR 400,000アルファ2ベータ2複合体として移動しました（250語で切り捨てられた要約）

The subunit composition of the dithiothreitol- (DTT) activated insulin receptor/kinase was examined by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration chromatography under denaturing (0.1% SDS) or nondenaturing (0.1% Triton X-100) conditions. Pretreatment of 32P-labeled insulin receptors with 50 mM DTT followed by gel filtration chromatography in 0.1% SDS demonstrated the dissociation of the alpha 2 beta 2 insulin receptor complex (Mr 400,000) into the monomeric 95,000 beta subunit. In contrast, pretreatment of the insulin receptors with 1-50 mM DTT followed by gel filtration chromatography in 0.1% Triton X-100 resulted in no apparent alteration in mobility compared to the untreated insulin receptors. Resolution of this complex by nonreducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography demonstrated the existence of the alpha 2 beta 2 heterotetrameric complex with essentially no alpha beta heterodimeric or free monomeric beta subunit species present. This suggests that the insulin receptor can reoxidize into the Mr 400,000 complex after the removal of DTT by gel filtration chromatography. Surprisingly, these apparently reoxidized insulin receptors were also observed to be functional with respect to insulin binding, albeit with a 50% decrease in affinity for insulin and insulin stimulation of the beta subunit autophosphorylation. To prevent reoxidation, the insulin receptors were pretreated with 50 mM DTT followed by incubation with excess N-ethylmaleimide prior to gel filtration chromatography in 0.1% Triton X-100. Under these conditions the insulin receptors migrated as the Mr 400,000 alpha 2 beta 2 complex.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)