相同組換えと1ラウンドPCR産物を使用してLB培地で発現する大腸菌ソルビビトール強化グルコース再抑制SRLAプロモーターの同定と変異解析

大腸菌は、長年にわたって組換えタンパク質産生に使用されてきました。ただし、LB培地での構成的発現については、ネイティブの大腸菌プロモーターは見つかりませんでした。LB培地でアクティブな高発現大腸菌プロモーターを得るために、赤い蛍光タンパク質をコードするEEMRFPの上流のさまざまなプロモーター領域を挿入しました。選択されたプロモーターの中で、SRLAプロモーター形質転換体のコロニーのみがLBプレートで赤くなりました。SRLAは、ソルビトールの利用を調節する遺伝子です。ソルビトールの添加により、EEMRFP発現が増強されましたが、グルコースと他の糖が抑制され、SRLAPがソルビトール強化グルコース抑制プロモーターであることを示しています。SRLAPシーケンスを分析するために、新しいサイト指向の突然変異誘発法が開発されました。大腸菌での相同組換えが12 bpシーケンスの間で発生する可能性があることを実証したため、「1ラウンドPCR産物」と示された完全な長さのプラスミドを生成するように設計されたプライマーのセットに12 bpオーバーラップ配列が取り付けられました。この方法を使用して、SRLAプロモーター領域が100 bpであることを確認しました。さらに、スタートコドンに隣接する配列は、高発現に不可欠であることがわかりました。これは、プロモーター領域でクローニングするために従来使用されていた制限酵素部位が発現を妨げていることを示唆しています。1ラウンドPCR産物を使用したSRLA駆動型発現システムとDNA操作は、大腸菌の遺伝子工学における有用なツールです。

Escherichia coli has been used for recombinant protein production for many years. However, no native E. coli promoters have been found for constitutive expression in LB medium. To obtain high-expression E. coli promoters active in LB medium, we inserted various promoter regions upstream of eEmRFP that encodes a red fluorescent protein. Among the selected promoters, only colonies of srlA promoter transformants turned red on LB plate. srlA is a gene that regulates sorbitol utilization. The addition of sorbitol enhanced eEmRFP expression but glucose and other sugars repressed, indicating that srlAp is a sorbitol-enhanced glucose-repressed promoter. To analyze the srlAp sequence, a novel site-directed mutagenesis method was developed. Since we demonstrated that homologous recombination in E. coli could occur between 12-bp sequences, 12-bp overlapping sequences were attached to the set of primers that were designed to produce a full-length plasmid, denoted "one-round PCR product." Using this method, we identified that the srlA promoter region was 100 bp. Further, the sequence adjacent to the start codon was found to be essential for high expression, suggesting that the traditionally used restriction enzyme sites for cloning in the promoter region have hindered expression. The srlA-driven expression system and DNA manipulation with one-round PCR products are useful tools in E. coli genetic engineering.