ニューロンで特異的にレシオメトリックオートファジープローブのトランスジェニック発現により、in vivoでの脳オートファジーの尋問が可能になります

オートファジー - リソソーム経路（ALP）の破壊は、複数の神経変性疾患で病原性と考えられています。ただし、現在の方法は、in vivoおよびその治療的調節における脳におけるマクロオートファジー/オートファジーフラックスを調査するのに不十分です。ここでは、ニューロンで選択的にトランスジェネシスによってデュアル蛍光タグ付きLC3（TFLC3、MRFP-EGFP-LC3）を安定して発現する新しいオートファジーレポーターマウス（TRGL6）について説明します。TFLC3プローブは、脊髄を含む中枢神経系に広く分布しています。発現レベルは内因性LC3と類似しており、検出可能なALPの変化を誘発しませんでした。この比率レポーターは、オートファゴソームが形成され、リソソームと融合し、酸性化し、オートリソソーム内の基質を分解し、劣化させる色のpH依存性の変化を登録します。特定の実験的ALP摂動後のニューロンオートファジーフラックスの予測された変化を確認しました。さらに、TRGL6脳の3番目の蛍光標識を使用して、免疫細胞化学によるリソソームを特定するために、in vivoで欠陥のあるオートリソソーム酸性化を検出するための新しい手順を検証しました。したがって、TRGL6マウスは、神経疾患、老化、および疾患修飾剤に関連して、特定のニューロン集団のin vivo ALPダイナミクスを調査するためのユニークなツールを表しています。略語：Actb：Actin、Beta;AD：アルツハイマー病;AL：オートリソソーム;ALP：オートファジー - リソソーム経路。AP：オートファゴソーム;APP：アミロイドベータ（ABETA）前駆体タンパク質。ATG5：オートファジー関連5;ATG7：オートファジー関連7;AV：オートファジー液胞;CNS：中枢神経系;CTSD：カテプシンD;CQ：クロロキン;DMEM：Dulbeccoの変更されたイーグルの媒体。GFP：緑色の蛍光タンパク質;GABARAP：ガンマアミノ酪酸受容体関連タンパク質。GABARAPL2/GATE16：ガンマアミノ酪酸（GABA）受容体関連タンパク質様2;ICC：免疫細胞化学;ICV：脳室内;LAMP2：リソソーム関連膜タンパク質2;Leup：Leupeptin;ly：リソソーム;MAP1LC3/LC3：微小管関連タンパク質1軽鎖3;MTOR：ラパマイシンキナーゼの機械的標的。RBFOX3/NEUN：RNA結合タンパク質、FOX-1ホモログ（C. elegans）3;RFP：赤蛍光タンパク質。RPS6KB1：リボソームタンパク質S6キナーゼ、ポリペプチド1;SDS-PAGE：ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;SQSTM1：SemeStosome 1;TFLC3：MRFP-EGFP-LC3;TRGL6：THY1 MRFP EGFP LC3-LINE 6;PCR：ポリメラーゼ連鎖反応;PD：パーキンソン病。

Autophagy-lysosome pathway (ALP) disruption is considered pathogenic in multiple neurodegenerative diseases; however, current methods are inadequate to investigate macroautophagy/autophagy flux in brain in vivo and its therapeutic modulation. Here, we describe a novel autophagy reporter mouse (TRGL6) stably expressing a dual-fluorescence-tagged LC3 (tfLC3, mRFP-eGFP-LC3) by transgenesis selectively in neurons. The tfLC3 probe distributes widely in the central nervous system, including spinal cord. Expression levels were similar to endogenous LC3 and induced no detectable ALP changes. This ratiometric reporter registers differential pH-dependent changes in color as autophagosomes form, fuse with lysosomes, acidify, and degrade substrates within autolysosomes. We confirmed predicted changes in neuronal autophagy flux following specific experimental ALP perturbations. Furthermore, using a third fluorescence label in TRGL6 brains to identify lysosomes by immunocytochemistry, we validated a novel procedure to detect defective autolysosomal acidification in vivo. Thus, TRGL6 mice represent a unique tool to investigate in vivo ALP dynamics in specific neuron populations in relation to neurological diseases, aging, and disease modifying agents. Abbreviations: ACTB: actin, beta; AD: Alzheimer disease; AL: autolysosomes; ALP: autophagy-lysosome pathway; AP: autophagosome; APP: amyloid beta (Abeta) precursor protein; ATG5: autophagy related 5; ATG7: autophagy related 7; AV: autophagic vacuoles; CNS: central nervous system; CTSD: cathepsin D; CQ: chloroquine; DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium; GFP: green fluorescent protein; GABARAP: gamma-aminobutyric acid receptor associated protein; GABARAPL2/GATE16: gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor-associated protein-like 2; ICC: immunocytochemistry; ICV: intra-cerebroventricular; LAMP2: lysosomal-associated membrane protein 2; Leup: leupeptin; LY: lysosomes; MAP1LC3/LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3; MTOR: mechanistic target of rapamycin kinase; RBFOX3/NeuN: RNA binding protein, fox-1 homolog (C. elegans) 3; RFP: red fluorescent protein; RPS6KB1: ribosomal protein S6 kinase, polypeptide 1; SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SQSTM1: sequestosome 1; tfLC3: mRFP-eGFP-LC3; TRGL6: Thy1 mRFP eGFP LC3-line 6; PCR: polymerase chain reaction; PD: Parkinson disease.