ORICおよびProtein n '認識部位での大腸菌ミニクロモソーム複製の開始in vitroでDNA合成を開始するための2つのモード

DNA鎖を導き、遅延させるための開始部位は、ミニクロモソームをテンプレートとしてin vitroで決定しました。複製中間体からのフラグメントは、ハイブリダイゼーションにより一本鎖プローブまで分析されました。反時計回り方向における先頭鎖合成は、最小起源であるか（位置248〜 -44）に発生するか、またはそれに近いことがわかりました。補完的な遅れた鎖合成は、ORICの外側の左側にいくつかの位置を開始しました。結果は、さらに、二本鎖ORICC DNA（プレリソーム）でのDNAA指向開始タンパク質のアセンブリに続くリーディングおよび遅れた鎖の協調合成を示唆しています。さらに、DNA合成は、ASNA遺伝子に時計回りにあるタンパク質N '認識シーケンスで開始できます。n 'サイトでの開始はタンパク質I活性に依存していましたが、ORIC領域での先頭および遅れた鎖開始はタンパク質Iの影響を受けませんでした。私たちの結果は、ORICでの不連続DNA合成の開始におけるPHI X174タイプのプリモソームの関与に反対しています。代替機能が提案されています。

The start sites for leading and lagging DNA strands were determined in vitro with minichromosomes as templates. Fragments from replication intermediates were analyzed by hybridization to single-stranded probes. Leading strand synthesis in the counterclockwise direction was found to originate in or close to (position 248 to -44) the minimal origin. Complementary lagging strand synthesis started several positions to the left outside of oriC. The results suggest in addition a concerted synthesis of leading and lagging strands following the dnaA directed assembly of initiation proteins at double-stranded oricC DNA (pre-replisome). In addition, DNA synthesis could initiate at protein n' recognition sequences located within and clockwise to the asnA gene. Initiation at n' sites was dependent on protein i activity, whereas leading and lagging strand initiation in the oriC region was not affected by protein i. Our results argue against an involvement of the phi X174-type primosome in the initiation of discontinuous DNA synthesis at oriC. An alternative function is suggested.