キナーゼ触媒架橋と免疫沈降を使用したキナーゼとp53の相互作用の同定

キナーゼ酵素は、細胞シグナル伝達を制御するために高度に秩序化された方法でタンパク質基質をリン酸化します。規制されていないキナーゼ活性は、さまざまな疾患状態、特に癌に関連しているため、疾患形成を理解するために重要な細胞におけるキナーゼ活性の特性評価があります。ただし、利用可能なツールの不足により、細胞機能に関与するキナーゼの基質と相互作用タンパク質の完全なマッピングが妨げられています。最近、キナーゼ触媒架橋を開発して、共有結合基質とキナーゼをリン酸化依存的に接続しました。ここでは、キナーゼ類堆積と免疫沈降（K-Clip）を組み合わせた新しい方法を報告し、キナーゼ層状ペアとキナーゼ関連タンパク質を特定します。K-Clipは基質P53に適用され、これは堅牢にリン酸化されています。p53の既知のキナーゼと未知のキナーゼの両方が、Kクリップを使用して細胞溶解物から分離されました。フォローアップ検証研究では、MRCKBETAが新しいP53キナーゼとして特定されました。キナーゼを超えて、細胞相互作用のスナップショットを提供するK-Clipを使用して、さまざまなp53およびキナーゼ関連タンパク質も同定されました。K-Clip法は、細胞内のキナーゼ基質ペアとマルチタンパク質複合体を特定するためのすぐに有用な化学ツールを表します。これは、正常状態および疾患状態におけるキナーゼ活性の研究と理解を高める細胞のシグナル伝達を促進します。

Kinase enzymes phosphorylate protein substrates in a highly ordered manner to control cell signaling. Unregulated kinase activity is associated with a variety of disease states, most notably cancer, making the characterization of kinase activity in cells critical to understand disease formation. However, the paucity of available tools has prevented a full mapping of the substrates and interacting proteins of kinases involved in cellular function. Recently we developed kinase-catalyzed cross-linking to covalently connect substrate and kinase in a phosphorylation-dependent manner. Here, we report a new method combining kinase-catalyzed cross-linking and immunoprecipitation (K-CLIP) to identify kinase-substrate pairs and kinase-associated proteins. K-CLIP was applied to the substrate p53, which is robustly phosphorylated. Both known and unknown kinases of p53 were isolated from cell lysates using K-CLIP. In follow-up validation studies, MRCKbeta was identified as a new p53 kinase. Beyond kinases, a variety of p53 and kinase-associated proteins were also identified using K-CLIP, which provided a snapshot of cellular interactions. The K-CLIP method represents an immediately useful chemical tool to identify kinase-substrate pairs and multiprotein complexes in cells, which will embolden cell signaling research and enhance our understanding of kinase activity in normal and disease states.