血液分析器を使用した活性酸素種生産による活性化好中球の検出

好中球は、感染部位に補充され、食作用および反応性酸素種（ROS）産生によって細菌を殺します。液胞はROSを産生する好中球に存在し、細菌感染症の患者の血液塗抹標本に多数存在することが報告されています。SYSMEX自動化された血液分析装置の白血球分化機能は、フローサイトメトリーによって白血球を分類します。特に、サイドスカターの光は、オルガネラの量を反映することが知られています。この研究では、血液学分析器を使用してROSを産生する好中球における液胞を検出したり、細胞膜の浸潤を検出したりする可能性を調査しました。全血および多核核（PMN）細胞画分を、ホルボールミリス酸アセテート（PMA）またはホルミエルメチオンルキルフェニルアラニン（FMLP）で活性化し、SYSMEX XE-2100自動血液学分析因子を使用して分析しました。PMN画分は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）、電子顕微鏡（EM）、および一般的な従来のフローサイトメーターで形態学的に分析されました。この分析で得られた白血球分化散布図では、元の好中球クラスターとは別の新しいクラスターが、より高い側散乱（SSC）強度の領域の好酸球領域に現れました。PMN画分のフローサイトメトリー分析により、この新しいクラスターの細胞はCD16BおよびAPF陽性であることが明らかになり、細胞がROSを産生する好中球を活性化したことを示しています。CLSMとEMの所見は、ROS産生が細胞質で発生し、活性化された好中球には、液胞の液胞様構造または細胞膜の侵入が含まれていることが明らかになりました。液胞様STructuresは、ROSを産生する好中球の細胞質内で発見されました。これらの好中球は、白血球様構造がSSC強度を増加させたため、おそらく白血球分化散布グラム上の従来のクラスターの好中球が示すよりも高いSSC強度の好酸球領域の独立したクラスターとして検出されました。

Neutrophils are recruited to infection sites and kill bacteria by phagocytosis and reactive oxygen species (ROS) production. It has been reported that vacuoles are present in neutrophils that produce ROS and are present in large numbers in blood smears of patients with bacterial infections. The leukocyte differentiation function on the Sysmex automated hematology analyzer classifies leukocytes by flow cytometry. Particularly, side-scattered light is known to reflect the quantity of organelles. This study investigated the possibility of detecting vacuoles or invagination of cell membrane in neutrophils producing ROS using a hematology analyzer. Whole blood and polymorphonuclear (PMN) cell fractions were activated with phorbol myristate acetate (PMA) or formylmethionylleucylphenylalanine (fMLP) and analyzed using the Sysmex XE-2100 automated hematology analyzer. PMN fractions were morphologically analyzed with a confocal laser scanning microscope (CLSM), electron microscope (EM), and general-purpose conventional flow cytometer. In the white blood cell differentiation scattergram obtained in this analysis, a new cluster separate from the original neutrophil cluster appeared in the eosinophil area in an area of higher side-scattering (SSC) intensity. Flow cytometry analysis of the PMN fractions revealed that the cells in this new cluster were CD16b- and APF-positive, indicating that the cells were activated neutrophils that produced ROS. CLSM and EM findings revealed that ROS production occurred in the cytoplasm and that the activated neutrophils contained some vacuole-like structures of vacuoles or invagination of cell membrane. Vacuole-like Sstructures were found within the cytoplasm of neutrophils producing ROS. These neutrophils were detected as an independent cluster in the eosinophil area with higher SSC intensity than that shown by neutrophils in the traditional cluster on the white blood cell differentiation scattergram, likely because the vacuole-like structures increased the SSC intensity.