ギブソンアセンブリによるヒトアデノウイルスタイプ14の複製能力感染クローンの迅速な構築

1955年、オランダの急性呼吸器疾患（ARD）と診断された軍の研修生で、ヒトアデノウイルス14型（HADV-B14P）が最初に特定されました。50年後、ゲノムバリアントであるHADV-B14P1が米国に再出現し、大規模で致命的なARDの発生を引き起こしました。その後、軍事および市民の両方の環境で、カナダ、英国、アイルランド、および中国でますます多くのARD発生が発生しました。この新しいゲノムバリアントの効率的な特性評価のためのツールを生成するために、Hadv-B14のフルレングス感染性ゲノムクローンが、この研究でワンステップギブソンアセンブリ法を使用して成功裏に構築されました。第一に、中国で最初のHADV-B14分離株であるHadv-B14P1株GZ01の完全なゲノムを、ギブソンアセンブリによりPBR322プラスミドに組み立てました。ギブソンアセンブリによって生成されたPBRADV14プラスミドは、PCR、制限酵素消化、シーケンスによって分析および検証されました。第二に、ウイルスはPBRADV14トランスフェクトA549細胞から救助されました。救助されたウイルスの完全性は、制限酵素分析によって特定されました。感染性クローンの完全なシーケンスをさらにシーケンスしました。親のウイルスおよびPBR322配列と比較した場合、構造中に感染性クローンに変異は見つかりませんでした。直接的な免疫蛍光アッセイは、ヘキソンタンパク質の発現を示していました。最後に、典型的なビリオンが観察されました。1段階の成長曲線はさらに、PBRAD14由来ウイルスのDNA複製とウイルス繁殖効率が、野生型Hadv-B14株のそれと類似していることを示しました。PBRADV14の複製に適した感染性クローンの構造が成功したことは、Hadv-B14に対するワクチンおよび抗ウイルス薬の開発を促進し、他の大型DNAウイルスの感染性ウイルスクローンの迅速な構築のための新しい戦略を提供します。

In 1955, Human adenovirus type 14 (HAdV-B14p) was firstly identified in a military trainee diagnosed as acute respiratory disease (ARD) in the Netherlands. Fifty years later, a genomic variant, HAdV-B14p1, re-emerged in the U.S. and caused large and fatal ARD outbreaks. Subsequently, more and more ARD outbreaks occurred in Canada, the UK, Ireland, and China, in both military and civil settings. To generate a tool for the efficient characterization of this new genomic variant, a full-length infectious genomic clone of HAdV-B14 was successfully constructed using one-step Gibson Assembly method in this study. Firstly, the full genome of HAdV-B14p1 strain GZ01, the first HAdV-B14 isolate in China, was assembled into pBR322 plasmid by Gibson Assembly. The pBRAdV14 plasmid, generated by Gibson Assembly, was analyzed and verified by PCR, restriction enzymes digestion and the sequencing. Secondly, viruses were rescued from pBRAdV14-transfected A549 cells. The integrity of the rescued viruses was identified by restriction enzyme analysis. The complete sequence of the infectious clone was further sequenced. No mutation was found in the infectious clone during the construction when compared with the parental virus and pBR322 sequences. The direct immunofluorescence assay indicated the expression of the hexon protein. Finally, typical virions were observed; the one-step growth curves further showed that the DNA replication and viral reproduction efficiency of pBRAd14 derived viruses was similar with that of wild-type HAdV-B14 strain. The successful construction of the replication-competent infectious clone of pBRAdV14 facilitates the development of vaccine and antiviral drugs against HAdV-B14, as well as provides a novel strategy for rapid construction of infectious viral clones for other large-genome DNA viruses.