ZFNまたはCRISPR/CAS9によって媒介される単一のクロスオーバーを介したヒト細胞の標的統合

背景：ターゲットDNA統合は、導入遺伝子発現に対する位置効果を排除するため、基礎研究および商業用途で広く使用されています。哺乳類細胞の標的統合は、一般に、ゲノムと、目的の遺伝子に隣接する2つの相同性群を含む線形ドナーとの間の二重クロスオーバーイベントを通じて達成されます。ただし、この戦略は一般に、より大きなDNAフラグメントを導入するのに効率が低いです。相同性に依存しないNHEJメカニズムを使用すると、ターゲットサイトでより大きなDNAフラグメントを統合する効率を改善することが最近示されていますが、このメカニズムを介した統合は方向に依存しません。したがって、効率の向上を伴う方向依存の統合のための新しい方法の開発が望まれます。 結果：ヒトCCR5遺伝子にZFNSまたはCRISPR/CAS9を使用して、ゲノムのCCR5遺伝子に相応した1.6 kbフラグメントを含むドナープラスミドを使用して、部位固有の二本鎖切断を生成しました。これらのDSBは、シングルクロスオーバー組換えを介して、6.4 kbプラスミドの2つのヒト細胞株のゲノムへの方向依存性統合を効率的に駆動しました。統合は方向依存性であり、ゲノムにおける相同性領域の重複をもたらし、ドナープラスミドの別のコピーの統合を可能にしました。CRISPR/CAS9システムは、複製された相同性領域内のSGRNA結合部位を破壊する傾向があり、別のプラスミドドナーの統合を防ぎました。対照的に、ZFNは結合部位を完全に破壊する可能性が低く、追加のプラスミドドナーコピーの連続的な統合が可能になりました。これは、組換えタンパク質の高レベル発現のためのマルチコピー統合を促進するのに役立ちます。クローン細胞のサザンブロット分析によって明らかにされたように、単一のクロスオーバー組換えによる標的統合は非常に効率的でした（頻度：33％）。これは、約5 kbの長いDNAフラグメントをノックするために使用された以前に記載されたNHEJベースの方法（0.17-0.45％）よりも効率的です。 結論：単一のクロスオーバー組換えを介して、大きなDNAフラグメントの方向依存性統合の方法を開発しました。私たちは、NHEJを介した培養細胞のゲノムにDNAカセットの方向に依存しない統合のための以前に報告された手法と、私たちの方法を比較し、対比しました。私たちの方法は、その方向性と大きな断片を効率的に統合する能力により、基礎研究と産業用途の両方にとって魅力的な戦略です。

BACKGROUND: Targeted DNA integration is widely used in basic research and commercial applications because it eliminates positional effects on transgene expression. Targeted integration in mammalian cells is generally achieved through a double crossover event between the genome and a linear donor containing two homology arms flanking the gene of interest. However, this strategy is generally less efficient at introducing larger DNA fragments. Using the homology-independent NHEJ mechanism has recently been shown to improve efficiency of integrating larger DNA fragments at targeted sites, but integration through this mechanism is direction-independent. Therefore, developing new methods for direction-dependent integration with improved efficiency is desired. RESULTS: We generated site-specific double-strand breaks using ZFNs or CRISPR/Cas9 in the human CCR5 gene and a donor plasmid containing a 1.6-kb fragment homologous to the CCR5 gene in the genome. These DSBs efficiently drove the direction-dependent integration of 6.4-kb plasmids into the genomes of two human cell lines through single-crossover recombination. The integration was direction-dependent and resulted in the duplication of the homology region in the genome, allowing the integration of another copy of the donor plasmid. The CRISPR/Cas9 system tended to disrupt the sgRNA-binding site within the duplicated homology region, preventing the integration of another plasmid donor. In contrast, ZFNs were less likely to completely disrupt their binding sites, allowing the successive integration of additional plasmid donor copies. This could be useful in promoting multi-copy integration for high-level expression of recombinant proteins. Targeted integration through single crossover recombination was highly efficient (frequency: 33%) as revealed by Southern blot analysis of clonal cells. This is more efficient than a previously described NHEJ-based method (0.17-0.45%) that was used to knock in an approximately 5-kb long DNA fragment. CONCLUSION: We developed a method for the direction-dependent integration of large DNA fragments through single crossover recombination. We compared and contrasted our method to a previously reported technique for the direction-independent integration of DNA cassettes into the genomes of cultured cells via NHEJ. Our method, due to its directionality and ability to efficiently integrate large fragments, is an attractive strategy for both basic research and industrial application.