ゲノム全体のRNA-seq分析とスプライシングレポーターアッセイによる非標準的な5 'スプライス部位の使用

5 'スプライス部位のほとんどのヒト病原性変異は、+1および+2の位置の標準的なGTに影響を及ぼし、非癌性ジヌクレオチドにつながります。一方、すべてのヒト5'sの約1％で、生理学的条件下で非癌性ジヌクレオチドが観察されます。したがって、非標準5'sが使用される条件の根底にある病原性変異メカニズムを理解することは困難な作業です。この作業では、実験的にスプライシング競争記者を使用して、24億個のエクソンジャンクションをカバーする合計24億のギャップ読み取りを含む27人の被験者から54の線維芽細胞サンプルの大規模なRNA-seqデータセットを分析することにより、非癌性5 'スプライス部位選択を体系的に調べました。両方のアプローチから、> ga> gg> ct at> ga> gg> ct at at> gc> tt> at gc> tt>を一貫して導き出しました。私たちの競争スプライシングレポーターアッセイでは、非標準的なスプライシングは、上流または下流のスプライシング調節要素（SRES）の存在に厳密に依存しており、SRESの変化は、競合する5'sのU1 SNRNA相補性の変動によって補償される可能性があります。特に、GCよりも「弱い」すべての非癌性ジヌクレオチドのスプライス部位の異なる位置（すなわち、-1、+1、+5）でのスプライシングを確認できます。包括的なRNA-seqデータセット分析では、高度に発現した遺伝子の弱く使用されているエクソン接合部では、非標準的な5'sが優先的に検出されました。自信の高いスプライス部位の中で、それらは、隣接する、より頻繁に使用される5'sを備えたクラスターで10倍の過剰に表現されていました。逆に、これらのより頻繁に使用される隣人には、上記のランキングに従って、ジヌクレオチドGT、GC、およびTTのみが含まれていました。

Most human pathogenic mutations in 5' splice sites affect the canonical GT in positions +1 and +2, leading to noncanonical dinucleotides. On the other hand, noncanonical dinucleotides are observed under physiological conditions in ∼1% of all human 5'ss. It is therefore a challenging task to understand the pathogenic mutation mechanisms underlying the conditions under which noncanonical 5'ss are used. In this work, we systematically examined noncanonical 5' splice site selection, both experimentally using splicing competition reporters and by analyzing a large RNA-seq data set of 54 fibroblast samples from 27 subjects containing a total of 2.4 billion gapped reads covering 269,375 exon junctions. From both approaches, we consistently derived a noncanonical 5'ss usage ranking GC > TT > AT > GA > GG > CT. In our competition splicing reporter assay, noncanonical splicing was strictly dependent on the presence of upstream or downstream splicing regulatory elements (SREs), and changes in SREs could be compensated by variation of U1 snRNA complementarity in the competing 5'ss. In particular, we could confirm splicing at different positions (i.e., -1, +1, +5) of a splice site for all noncanonical dinucleotides "weaker" than GC. In our comprehensive RNA-seq data set analysis, noncanonical 5'ss were preferentially detected in weakly used exon junctions of highly expressed genes. Among high-confidence splice sites, they were 10-fold overrepresented in clusters with a neighboring, more frequently used 5'ss. Conversely, these more frequently used neighbors contained only the dinucleotides GT, GC, and TT, in accordance with the above ranking.