CRISPR-CAS9核酸二重エネルギーパラメーターを使用したターゲティングオフターゲティング評価

背景：CRISPR-CAS9システムの最近の実験的努力は、ターゲット外の結合と切断がシステムの懸念であり、これが選択されたガイドRNA（GRNA）設計に大きく依存していることを示しています。オフターゲットの計算予測は、退屈な実験的努力の魅力的で実行可能な代替手段として提案されています。ただし、多くの推定オフターゲットの正確なスコアリングは、計算オフターゲティング評価の成功に重要な役割を果たします。 結果：cas9-gRNA-DNA複合体のおおよその結合エネルギーモデルを提示します。これは、RNA-RNA、DNA-DNA、およびRNA-DNA二重鎖について得られたエネルギーパラメーターを体系的に組み合わせます。このモデルに基づいて、CRISPR-CAS9アプリケーションでのGRNA選択のための2つの新しいターゲットオフターゲット評価方法が導入されています。CRISPROFFは、GRNAの特異性を測定する予測オフターゲットに信頼性スコアを割り当て、CRISPRSPECを割り当てます。現在の最先端の方法に対してメソッドをベンチマークし、両方が実験結果とよりよく一致していることを示します。さらに、導入された結合エネルギーが重要なコンポーネントであるシステムのターゲット上の切断効率と特異性との逆の関係を支持する重要な証拠を示します。 結論：結合エネルギーの影響は、ターゲティングメカニズムのさらなる研究の方向性を提供します。CRISPROFFとCRISPRSPECのパフォーマンスにより、CRISPR-CAS9ゲノム編集アプリケーションの前に、GRNA選択のより正確なオフターゲット評価が可能になります。与えられたGRNA配列または特定のターゲット領域のすべての潜在的なGRNAについては、CRISPROFFベースのオフターゲット予測とCRISPRSPECベースの特異性評価をWebサーバーhttps://rth.dk/resources/crispr/を通じて実行できます。

BACKGROUND: Recent experimental efforts of CRISPR-Cas9 systems have shown that off-target binding and cleavage are a concern for the system and that this is highly dependent on the selected guide RNA (gRNA) design. Computational predictions of off-targets have been proposed as an attractive and more feasible alternative to tedious experimental efforts. However, accurate scoring of the high number of putative off-targets plays a key role for the success of computational off-targeting assessment. RESULTS: We present an approximate binding energy model for the Cas9-gRNA-DNA complex, which systematically combines the energy parameters obtained for RNA-RNA, DNA-DNA, and RNA-DNA duplexes. Based on this model, two novel off-target assessment methods for gRNA selection in CRISPR-Cas9 applications are introduced: CRISPRoff to assign confidence scores to predicted off-targets and CRISPRspec to measure the specificity of the gRNA. We benchmark the methods against current state-of-the-art methods and show that both are in better agreement with experimental results. Furthermore, we show significant evidence supporting the inverse relationship between the on-target cleavage efficiency and specificity of the system, in which introduced binding energies are key components. CONCLUSIONS: The impact of the binding energies provides a direction for further studies of off-targeting mechanisms. The performance of CRISPRoff and CRISPRspec enables more accurate off-target evaluation for gRNA selections, prior to any CRISPR-Cas9 genome-editing application. For given gRNA sequences or all potential gRNAs in a given target region, CRISPRoff-based off-target predictions and CRISPRspec-based specificity evaluations can be carried out through our webserver at https://rth.dk/resources/crispr/ .