ドキソルビシンチオールコンジュゲートおよびドキソルビシン-SS-cyclicペプチドの合成および抗増殖活性

薬物流出によって引き起こされる心筋毒性と薬剤耐性は、ドキソルビシン（DOX）ベースの化学療法の大きな制限です。DOX構造の修飾は、抗増殖活性やより高い細胞保持など、生物学的プロファイルが改善されたコンジュゲートを開発するために使用できます。したがって、DOXチオールコンジュゲート、DOXチオール（DOX-SH）、チオール反応性DOX-SSピリジン（SS =ジスルフィド）、およびDOX-SS-SSセル浸透環状ペプチド、DOX-SS- [C（WR）4K]を合成しました。DOXは、DOX-SHを生成するためにTrautの試薬と反応しました。チオール基は、対応するDOX-SS-ピリジン（DOX-SS-PYR）を提供するために、ジチョディオヒオフィリジンとの反応により活性化されました。FMOC固相戦略を使用して、システイン残基[C（WR）4K]を含む環状細胞透過性ペプチドを調製しました。DOX-SS-PYは、[C（WR）4K]のシステインの遊離スルフヒドリルと反応して、DOX-SS-[C（WR）4K]をDOX環式ペプチドコンジュゲートとして生成しました。化合物の細胞毒性は、ヒト胚性腎臓（HEK-293）、ヒト卵巣癌（SKOV-3）、ヒト線維肉腫（HT-1080）、およびヒト白血病（CCRF-CEM）細胞で検査されました。DOX-SHおよびDOX-SS-ピリジンは、おそらくこれらの細胞の化合物の活性と保持のために、24Hおよび72インキュベーション後に、HEK-293、HT-1080、およびCCRFセム細胞のDOXと比較した場合、有意に高くまたは同等の細胞毒性があることがわかりました。さらに、DOX-SS- [C（WR）4K]は、72Hインキュベーション後のDOXと比較した場合、HEK-293、HT-1080、およびSKOV-3細胞で有意に高い細胞毒性活性を示しました。DOX-SS-PYRは、フローサイトメトリーで示されるように、HT-1080およびHEK-293セルでDOX-SS- [C（WR）4K]よりも高い細胞摂取を示しました。4つの細胞株、HT-1080、SKOV-3、MDA-MB-468、およびMCF-7に示されているように、核に局在するDOX-SS-PYR、DOX-SH、およびDOX-SS- [C（WR）4K]がDOX-SS-PYR、DOX-SH、およびDOX-SS- [C（WR）4K]が示されました。注目すべきことに、DOX-SS- [C（WR）4K]は、同じ濃度のDOXと比較して、マウス筋芽細胞細胞では有意に毒性が低かった。さらに機械的研究により、DOX-SS-[C（WR）4K]に曝露した筋芽細胞細胞の細胞内反応性酸素種（ROS）のレベルは、FECL2と共処した場合にDOXの比較で減少したことが示されました。これらのデータは、DOX-SH、DOX-SS-PYR、およびDOX-SS- [C（WR）4K]がDOXの代替剤および抗がん剤としてさらに検討する可能性があることを示しています。

Myocardial toxicity and drug resistance caused by drug efflux are major limitations of doxorubicin (Dox)-based chemotherapy. Dox structure modification could be used to develop conjugates with an improved biological profile, such as antiproliferative activity and higher cellular retention. Thus, Dox thiol conjugates, Dox thiol (Dox-SH), thiol-reactive Dox-SS-pyridine (SS = disulfide), and a Dox-SS-cell-penetrating cyclic peptide, Dox-SS-[C(WR)4K], were synthesized. Dox was reacted with Traut's reagent to generate Dox-SH. The thiol group was activated by the reaction with dithiodipyridine to afford the corresponding Dox-SS-Pyridine (Dox-SS-Pyr). A cyclic cell-penetrating peptide containing a cysteine residue [C(WR)4K] was prepared using Fmoc solid-phase strategy. Dox-SS-Py was reacted with the free sulfhydryl of cysteine in [C(WR)4K] to generate Dox-SS-[C(WR)4K] as a Dox-cyclic peptide conjugate. Cytotoxicity of the compounds was examined in human embryonic kidney (HEK-293), human ovarian cancer (SKOV-3), human fibrosarcoma (HT-1080), and human leukemia (CCRF-CEM) cells. Dox-SH and Dox-SS-pyridine were found to have significantly higher or comparable cytotoxicity when compared to Dox in HEK-293, HT-1080, and CCRF-CEM cells after 24 h and 72 incubation, presumably because of higher activity and retention of the compounds in these cells. Furthermore, Dox-SS-[C(WR)4K] showed significantly higher cytotoxic activity in HEK-293, HT-1080, and SKOV-3 cells when compared with Dox after 72 h incubation. Dox-SS-Pyr exhibited higher cellular uptake than Dox-SS-[C(WR)4K] in HT-1080 and HEK-293 cells as shown by flow cytometry. Fluorescence microscopy exhibited that Dox-SS-Pyr, Dox-SH, and Dox-SS-[C(WR)4K] localized in the nucleus as shown in four cell lines, HT-1080, SKOV-3, MDA-MB-468, and MCF-7. Of note, Dox-SS-[C(WR)4K] was significantly less toxic in mouse myoblast cells compared to Dox at the same concentration. Further mechanistic study demonstrated that the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) in myoblast cells exposed to Dox-SS-[C(WR)4K] was reduced in comparison of Dox when co-treated with FeCl2. These data indicate that Dox-SH, Dox-SS-Pyr, and Dox-SS-[C(WR)4K] have the potential to be further examined as Dox alternatives and anticancer agents.