タイプIV CRISPR RNA処理とアロマトレウム芳香族のエフェクター複合体形成

タイプIV CRISPR-CASモジュールは、マルチサブユニットエフェクター複合体の存在によって定義されるクラス1原核生物適応免疫システムに属します。それらは通常、適応と標的の切断に関与する既知のCASタンパク質を欠いており、その機能は実験的に対処されていません。このCRISPR-CASタイプのRNAおよびタンパク質成分を調査するために、染色体に追加のI-C-Cシステムを含むAromatoleum aromaticum EBN1のメガプラスミド上の完全なタイプIV CAS遺伝子遺伝子座と隣接するCRISPRアレイを見つけました。RNAシーケンス分析により、両方のシステムのCRISPR RNA（CRRNA）の産生と成熟が検証されました。タイプIV CRRNAは、異常に短い7ヌクレオチド5'応答タグと安定した3 'ヘアピン構造を抱くことが示されました。IV型CRISPR-リボヌクレタンパク質（CRRNP）錯体に特異的に組み込まれたCRRNAを生成するCRRNAを生成するユニークなCas6バリアント（CSF5）が特定されました。RNA結合CSF5の構造が得られました。電子顕微鏡とともに、IV型CASタンパク質の組換え産生と精製は、CSF2がCSF5、CSF3、および大サブユニット（CSF1）を含むIV型CRRNPのヘリカル骨格として作用することを明らかにしました。質量分析分析では、特定のタンパク質間およびタンパク質-RNA接触部位が特定されました。これらの結果は、タイプIVとタイプI CRISPR-CASシステム間の進化的接続を強調し、タイプIV CRISPR-CASシステムがCRRNA誘導エフェクター複合体を使用していることを示しています。

Type IV CRISPR-Cas modules belong to class 1 prokaryotic adaptive immune systems, which are defined by the presence of multisubunit effector complexes. They usually lack the known Cas proteins involved in adaptation and target cleavage, and their function has not been experimentally addressed. To investigate RNA and protein components of this CRISPR-Cas type, we located a complete type IV cas gene locus and an adjacent CRISPR array on a megaplasmid of Aromatoleum aromaticum EbN1, which contains an additional type I-C system on its chromosome. RNA sequencing analyses verified CRISPR RNA (crRNA) production and maturation for both systems. Type IV crRNAs were shown to harbour unusually short 7 nucleotide 5'-repeat tags and stable 3' hairpin structures. A unique Cas6 variant (Csf5) was identified that generates crRNAs that are specifically incorporated into type IV CRISPR-ribonucleoprotein (crRNP) complexes. Structures of RNA-bound Csf5 were obtained. Recombinant production and purification of the type IV Cas proteins, together with electron microscopy, revealed that Csf2 acts as a helical backbone for type IV crRNPs that include Csf5, Csf3 and a large subunit (Csf1). Mass spectrometry analyses identified protein-protein and protein-RNA contact sites. These results highlight evolutionary connections between type IV and type I CRISPR-Cas systems and demonstrate that type IV CRISPR-Cas systems employ crRNA-guided effector complexes.