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妊娠関連糖タンパク質（PAG）は、妊娠中に胎児の栄養孔細胞によって発現します。ダムの循環におけるPAGの存在は、妊娠診断で広く使用されています。本研究では、妊娠初期のバッファローの異なるPAGアイソフォームの同定と特性評価が報告されています。胎児の子葉から分離されたPAG mRNA（妊娠段階：45、75、および90日）は、PJET1.2ベクターで正常にクローニングされ、大腸菌で形質転換されました。合計360のランダムクローンがシーケンスされ、それらの発現段階と相関しました。合計12個のアイソフォーム、すなわち、Bupag 1、2、4、6、7、8、9、13、15、16、18、および1つの新しいアイソフォームが識別されました。Bupag 7は、3つの段階すべてでBupag 18が続く最も豊富なアイソフォームとして発見されました。さらに、これらのアイソフォームのほとんどで多数のバリアントが見つかりました。識別されたBUPAGの系統発生関係は、Bupag 2が古代グループに属し、他のメンバーが現代のグループにクラスター化されていることを示しました。Bupag 7の3次元（3D）構造は、相同性モデリングと分子動的（MD）シミュレーションによって決定され、他のアスパラギックプロテイナーゼ（AP）ファミリーに表される典型的なfoldを示しました。Bupag 7を使用したペプスタチン阻害剤の分子ドッキングは、さまざまな水素結合と疎水性相互作用を介して相互作用することを明らかにしました。Bupag 7のペプチド結合裂け目でさまざまなアミノ酸置換が観察されました。Bupag7の相同構造との重複は、N末端の近くに35-41アミノ酸の長い挿入（2つのループで接続されたアルファヘリックス）の存在が明らかになりました。これは、バッファローのPAGアイソフォームの識別と配列の特性評価に関する最初のレポートであり、これらのアイソフォームは多くの転写型バリアントを表しているというユニークな発見です。また、最も豊富なアイソフォームBupag 7の3D構造を初めて報告します。
妊娠関連糖タンパク質（PAG）は、妊娠中に胎児の栄養孔細胞によって発現します。ダムの循環におけるPAGの存在は、妊娠診断で広く使用されています。本研究では、妊娠初期のバッファローの異なるPAGアイソフォームの同定と特性評価が報告されています。胎児の子葉から分離されたPAG mRNA（妊娠段階：45、75、および90日）は、PJET1.2ベクターで正常にクローニングされ、大腸菌で形質転換されました。合計360のランダムクローンがシーケンスされ、それらの発現段階と相関しました。合計12個のアイソフォーム、すなわち、Bupag 1、2、4、6、7、8、9、13、15、16、18、および1つの新しいアイソフォームが識別されました。Bupag 7は、3つの段階すべてでBupag 18が続く最も豊富なアイソフォームとして発見されました。さらに、これらのアイソフォームのほとんどで多数のバリアントが見つかりました。識別されたBUPAGの系統発生関係は、Bupag 2が古代グループに属し、他のメンバーが現代のグループにクラスター化されていることを示しました。Bupag 7の3次元（3D）構造は、相同性モデリングと分子動的（MD）シミュレーションによって決定され、他のアスパラギックプロテイナーゼ（AP）ファミリーに表される典型的なfoldを示しました。Bupag 7を使用したペプスタチン阻害剤の分子ドッキングは、さまざまな水素結合と疎水性相互作用を介して相互作用することを明らかにしました。Bupag 7のペプチド結合裂け目でさまざまなアミノ酸置換が観察されました。Bupag7の相同構造との重複は、N末端の近くに35-41アミノ酸の長い挿入（2つのループで接続されたアルファヘリックス）の存在が明らかになりました。これは、バッファローのPAGアイソフォームの識別と配列の特性評価に関する最初のレポートであり、これらのアイソフォームは多くの転写型バリアントを表しているというユニークな発見です。また、最も豊富なアイソフォームBupag 7の3D構造を初めて報告します。
Pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) are expressed during pregnancy by the trophoectodermal cells of fetus. Presence of PAGs in dam's circulation has been widely used in pregnancy diagnosis. The present study reports the identification and characterization of different PAG isoforms in buffalo during early stages of pregnancy. The PAG mRNAs isolated from fetal cotyledons (Pregnancy stages: 45, 75 and 90 days) were successfully cloned in pJET1.2 vector and transformed in E. coli. A total of 360 random clones were sequenced and correlated with their stages of expression. A total of 12 isoforms namely, BuPAG 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 13, 15, 16, 18 and one new isoform were identified. BuPAG 7 was found as the most abundant isoform in all three stages followed by BuPAG 18. Further, a large number of variants were found for most of these isoforms. Phylogenetic relationship of identified BuPAGs showed that BuPAG 2 belonged to an ancient group while other members clustered with modern group. Three-dimensional (3D) structure of BuPAG 7 was determined by homology modeling and molecular dynamic (MD) simulations which displayed a typical fold represented by other aspartic proteinase (AP) family members. Molecular docking of Pepstatin inhibitor with BuPAG 7 revealed to interact through various hydrogen bonding and hydrophobic interactions. Various amino acid substitutions were observed in peptide-binding cleft of BuPAG 7. Superimposition of BuPAG 7 with homologous structures revealed the presence of a 35-41 amino acid long insertion (alpha helix connected by two loops) near the N- terminus which seems to be a unique feature of BuPAG 7 in AP family. This is the first report on identification and sequence characterization of PAG isoforms in buffalo with unique finding that these isoforms represent many transcript variants. We also report 3D structure of the most abundant isoform BuPAG 7 for the first time.
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