プロトンドナーの除去は、Exiguobacterium sibiricumからの光駆動型プロトンポンプであるESRにおけるプロトン輸送の方向性と効率に強く影響します

Exiguobacterium sibiricumのESRは、プロトンポンプとして機能する網膜タンパク質です。ESRの異常な特徴は、リジン残留物が内部プロトンドナーの部位に存在することです。他のプロトンポンプでは、カルボン酸残基です。Lys96をアラニンに置き換えると、シッフ塩基の再配置が2桁遅くなり、Lys96と相互作用する水分子がシッフベースへの内部プロトンドナーとして機能することが示されます。この作業では、プロテオリポソームに再構成されたK96A変異体による光誘発電位Δψの生成時間解決を調べました。野生型ESRにおけるシッフ塩基の再配置に伴うΔψ成分は、変異体でも大幅に減少し、高いpHで負相が現れることがわかりました。これは、BR、D96N、およびD96Aの相同変異では陰性成分が観察されていないため、バクテリオロドプシンよりもESRの逆反応の可能性が高いことを示しています。ESRにおける逆反応のより高い速度は、おそらくBRおよびプロトン放出と取り込みの異なるシーケンスと比較して、プロトンアクセプター部位の異なる配置によって引き起こされます。内部プロトンドナーに代わるアジドナトリウムの添加は、K96A変異体のシッフ塩基再発に関連するΔψ成分の速度と振幅の両方を回復します。これは、全体的なプロトン輸送が順方向および逆反応の競合に起因することを示しており、H+移動の高効率と方向性に対する内部ドナーの重要性を強調しています。

ESR from Exiguobacterium sibiricum is a retinal protein which functions as a proton pump. Unusual feature of ESR is that a lysine residue is present at a site for the internal proton donor, which in other proton pumps is a carboxylic residue. Replacement of Lys96 with alanine slows reprotonation of the Schiff base by two orders of magnitude, indicating that Lys96 and interacting water molecules function as internal proton donor to the Schiff base. In this work we examined time resolved generation of light-induced electric potential ΔΨ by the K96A mutant reconstituted into proteoliposomes. We found that the ΔΨ component, which accompanied reprotonation of the Schiff base in wild type ESR, was not only slowed but also decreased greatly in the mutant, and negative phase appeared at high pH. This indicates a higher probability of back reactions in ESR than in bacteriorhodopsin since no negative components have been observed in homologous mutants of BR, D96N and D96A. The higher rate of back reactions in ESR is probably caused by different arrangement of the proton acceptor site compared to that in BR and different sequence of proton release and uptake. Addition of sodium azide, which substitutes for the internal proton donor, restores both the rate and amplitude of the ΔΨ components related to the Schiff base reprotonation in the K96A mutant. This indicates that overall proton transport results from competition of forward and reverse reactions, and emphasizes the importance of internal donor for high efficiency and directionality of H+ transfer.