炎症性腸疾患に関与する多病原体の検出とイメージングのためのマルチプレックスPCRおよびマルチカラー蛍光in situハイブリダイゼーション（M-fish）結合プロトコルの開発

背景：クローン病（CD）を含む炎症性腸疾患（IBD）で役割を果たすためにいくつかの病原体が議論されています。これらの病原体はどれも同じ臨床サンプルで一緒に調査されていません。マルチプレックスPCRと多色の蛍光in situハイブリダイゼーション（M-fish）プロトコルを開発しました。 方法：マルチプレックスPCRは、培養、血液、腸の生検からの細菌DNAの迅速な抽出のために修飾された1-HDNAZOL®抽出プロトコルに基づいています。これらの病原体に固有のオリゴヌクレオチドプライマー配列は、バイオインフォマティクスと実験的アプローチを使用して、個別に、および組み合わせで評価されました。M-fishは、蛍光タグ付きオリゴヌクレオチドと共焦点走行レーザー顕微鏡（CSLM）に基づいていました。 結果：いくつかの試みに続いて、オリゴヌクレオチドプライマーとDNAテンプレートの濃度とPCRアニーリング温度が最適化されました。多重PCR分析により、3つの異なる細菌のDNAの混合またはDNA抽出前の1つのチューブに混合された3つの細菌培養物の混合物に対して、2つのプライマーセットと3つのプライマーセットの組み合わせがテストされた試験で優れた増幅信号が明らかになりました。IBD患者の細菌培養および腸組織切片の個別および混合物を備えたスライドをM-fishでテストし、CSLM画像は3％アガロースゲルで検出された検証された多重PCR結果を検証しました。 結論：4-HマルチプレックスPCRプロトコルを開発しました。これは、CDに関連する主要な病原体から最大4つの遺伝子を検出できるM-Fish画像によって検証されました。新しいプロトコルは、CDや他の自己免疫疾患に関与する多パトゲンを研究する努力をサポートする優れたツールとして機能する必要があります。

BACKGROUND: Several pathogens have been debated to play a role in inflammatory bowel disease (IBD) including Crohn's disease (CD). None of these pathogens have been investigated together in same clinical samples. We developed a multiplex PCR and multi-color fluorescent in situ hybridization (m-FISH) protocols for simultaneous detection of CD-associated pathogens including Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), Klebsiella pneumoniae, and adherent-invasive Escherichia coli strain LF82. METHODS: The multiplex PCR is based on 1-h DNAzol® extraction protocol modified for rapid extraction of bacterial DNA from culture, blood, and intestinal biopsies. Oligonucleotide primers sequences unique to these pathogens were evaluated individually and in combinations using bioinformatics and experimental approaches. m-FISH was based on fluorescent-tagged oligonucleotides and confocal scanning laser microscopy (CSLM). RESULTS: Following several attempts, the concentration of the oligonucleotide primers and DNA templates and the PCR annealing temperatures were optimized. Multiplex PCR analyses revealed excellent amplification signal in trials where a single primer set and combinations of two and three primers sets were tested against a mixture of DNA from three different bacteria or a mixture of three bacterial cultures mixed in one tube before DNA extraction. Slides with individual and mixtures of bacterial cultures and intestinal tissue sections from IBD patients were tested by m-FISH and the CSLM images verified multiplex PCR results detected on 3% agarose gel. CONCLUSION: We developed a 4-h multiplex PCR protocol, which was validated by m-FISH images, capable of detecting up to four genes from major pathogens associated with CD. The new protocol should serve as an excellent tool to support efforts to study multi-pathogens involved in CD and other autoimmune disease.