エンコードされた2,3-ジアミノプロピオン酸を伴う生合成アシル酵素中間体をトラップします

多くの酵素は、共有結合アシル酵素（エステルまたはチオエステル）中間体を介して進行する反応を触媒します1。これらの酵素には、セリンヒドロラーゼ2,3（ヒト遺伝子の1％によってコードされ、セリンプロテアーゼとチオエステルゼを含む）、システインプロテアーゼ（カスパーゼを含む）、およびユビキチン化機構の多くの成分が含まれます4,5。それらの重要なアシル酵素中間体は不安定であり、一般的に数分から時間の半減期を抱えています6。場合によっては、アシル酵素複合体は、基質類似体または活性部位変異を使用して安定化することができますが、これらのアプローチは貴重な洞察7-10を提供できますが、多くの場合、実質的に非ネイティブな複合体をもたらします。ここでは、遺伝コード11の拡大を介して、2,3-ジアミノプロピオン酸（DAP）を組換えタンパク質に組み込むための戦略を開発します。酵素の触媒システインまたはセリン残基をDAPに置き換えると、在来基質との最初の段階の反応が可能になり、安定したアミド結合を介して関連するアシル酵素複合体の効率的な捕獲が可能になることを示しています。これらの酵素の1つであるバリノマイシンシンテターゼ12のチオエステラーゼドメインについては、テトラデプシペプチジルを徐々にオリゴマー化する生合成経路を解明します。DAPコンジュゲートとして触媒サイクルで最初と最後のアシル - チオエステラーゼ中間体を閉じ込めることにより、このような非リボソームペプチド合成酵素のチオエステラーゼドメインのコンフォメーション変化が、線形基質のオリゴマー化と環化をどのように制御するかについての構造的洞察を提供します。DAPのエンコードは、多様なアシル酵素複合体の特性評価を促進し、未知の機能の一時的にアシル化されたタンパク質の天然基質のキャプチャに拡張される可能性があります。

Many enzymes catalyse reactions that proceed through covalent acyl-enzyme (ester or thioester) intermediates1. These enzymes include serine hydrolases2,3 (encoded by one per cent of human genes, and including serine proteases and thioesterases), cysteine proteases (including caspases), and many components of the ubiquitination machinery4,5. Their important acyl-enzyme intermediates are unstable, commonly having half-lives of minutes to hours6. In some cases, acyl-enzyme complexes can be stabilized using substrate analogues or active-site mutations but, although these approaches can provide valuable insight7-10, they often result in complexes that are substantially non-native. Here we develop a strategy for incorporating 2,3-diaminopropionic acid (DAP) into recombinant proteins, via expansion of the genetic code11. We show that replacing catalytic cysteine or serine residues of enzymes with DAP permits their first-step reaction with native substrates, allowing the efficient capture of acyl-enzyme complexes that are linked through a stable amide bond. For one of these enzymes, the thioesterase domain of valinomycin synthetase12, we elucidate the biosynthetic pathway by which it progressively oligomerizes tetradepsipeptidyl substrates to a dodecadepsipeptidyl intermediate, which it then cyclizes to produce valinomycin. By trapping the first and last acyl-thioesterase intermediates in the catalytic cycle as DAP conjugates, we provide structural insight into how conformational changes in thioesterase domains of such nonribosomal peptide synthetases control the oligomerization and cyclization of linear substrates. The encoding of DAP will facilitate the characterization of diverse acyl-enzyme complexes, and may be extended to capturing the native substrates of transiently acylated proteins of unknown function.