プロトンスポンジトリガーのエンドソームの破裂と小さな干渉RNAのサイトゾル放出の超解像度イメージング

核酸およびタンパク質の細胞内送達は、生物学的治療の発生における重要な課題のままです。遺伝子治療では、リポプレックスまたはポリプレックスによるサイトゾルへの小さな干渉RNA（siRNA）の非効率的な送達は、しばしばエンドソームコンパートメントにおけるsiRNAペイロードの閉じ込めと分解に起因します。ポリプレックスがエンドソーム膜を破裂させ、核酸貨物を放出する可能性のあるメカニズムは、一般に「プロトンスポンジ効果」として定義されます。これは、ポリプレックスのプロトンバッファリング能力によってトリガーされる浸透駆動型プロセスです。ここでは、確率的光学再構成顕微鏡を使用して、個々のポリプレックスとエンドソームの分析を含むsiRNA人身売買プロセスの直接視覚化を通じて、「プロトンスポンジ効果」の分子基盤を調査します。地下構造、ポリプレックス、およびサイレンシングRNA分子の単一分子超解像度分析を通じて、連続siRNAの人身売買ステップをプローブします。具体的には、サイトゾル、およびサイトゾル内のポリプレックスの破壊、損傷したエンドソーム小胞の破裂時にサイトゾルで放出される個々の無傷のポリプレックスを調べます。ポリプレックスのアーキテクチャと陽イオンポリマー鎖の剛性は、プロトンスポンジ効果によって駆動されるエンドソームエスケープのメカニズムを制御する重要なパラメーターであることがわかります。グリコーゲンやポリエチレニミンなどの高度に分岐した硬質カチオン性ポリマーがシリカナノ粒子に固定されているため、プロトンスポンジ効果が浸透圧の膨張とエンドソームの破裂を誘導するのに効果的であるという証拠を提供します。

The intracellular delivery of nucleic acids and proteins remains a key challenge in the development of biological therapeutics. In gene therapy, the inefficient delivery of small interfering RNA (siRNA) to the cytosol by lipoplexes or polyplexes is often ascribed to the entrapment and degradation of siRNA payload in the endosomal compartments. A possible mechanism by which polyplexes rupture the endosomal membrane and release their nucleic acid cargo is commonly defined as the "proton sponge effect". This is an osmosis-driven process triggered by the proton buffering capacity of polyplexes. Herein, we investigate the molecular basis of the "proton sponge effect" through direct visualization of the siRNA trafficking process, including analysis of individual polyplexes and endosomes, using stochastic optical reconstruction microscopy. We probe the sequential siRNA trafficking steps through single molecule super-resolution analysis of subcellular structures, polyplexes, and silencing RNA molecules. Specifically, individual intact polyplexes released in the cytosol upon rupture of the endosomes, the damaged endosomal vesicles, and the disassembly of the polyplexes in the cytosol are examined. We find that the architecture of the polyplex and the rigidity of the cationic polymer chains are crucial parameters that control the mechanism of endosomal escape driven by the proton sponge effect. We provide evidence that in highly branched and rigid cationic polymers, such as glycogen or polyethylenimine, immobilized on silica nanoparticles, the proton sponge effect is effective in inducing osmotic swelling and rupture of endosomes.