癌細胞へのsiRNA送達のためのエキソソームの調製

細胞外小胞、特にエキソソームは、生物学的起源、豊富さ、およびさまざまな生体分子の細胞間送達における固有の能力により、新しい薬物送達ベクターとして最近関心を集めています。この作業は、siRNA送達のために高収量と高純度のエキソソームを達成するための分離プロトコルを確立します。ヒト胚性腎臓細胞（HEK-293細胞）はバイオリアクターフラスコで培養され、HEK-293エキソソームの濃縮を可能にするために、毎週培養上清（条件付き培地と呼ばれる）を毎週採取します。条件付けされた培地（cm）は、異なる遠心分離により死んだ細胞と細胞の破片が事前にクリアされており、スクロースクッションに続いて洗浄ステップが続き、エキソソームを収集するために洗浄段階にさらされます。単離されたHEK-293エキソソームは、それぞれナノ粒子追跡分析、タンパク質定量、電子顕微鏡、およびフローサイトメトリーによる収量、形態学、エキソソームマーカーの発現について特徴付けられます。ATTO655で蛍光標識された小さな干渉RNA（siRNA）は、エレクトロポレーションによりエキソソームにロードされ、過剰なsiRNAはゲルろ過によって除去されます。37°Cで24時間インキュベートした後、PANC-1がん細胞の細胞取り込みは、フローサイトメトリーによって確認されます。HEK-293エキソソームは、直径107.0±8.2 nmです。エキソソーム収率と粒子とタンパク質比（P：P）比は、それぞれ6.99±0.22×1012粒子/mLおよび8.3±1.7×1010粒子/µgです。エキソソームにおけるsiRNAのカプセル化効率は〜10〜20％です。細胞の40％は、インキュベーション後24時間でATTO655の正の信号を示しています。結論として、スクロースクッションへの超遠心分離によるエキソソーム分離は、良好な収量と純度の組み合わせを提供します。siRNAは、エレクトロポレーションによりエキソソームに正常にロードされ、その後in vitroで癌細胞に送達される可能性があります。このプロトコルは、癌細胞への効率的な送達のためにsiRNA充填エキソソームを開発するための標準的な手順を提供します。

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 °C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 ± 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 ± 0.22 × 1012 particle/mL and 8.3 ± 1.7 × 1010 particle/µg, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.