母体の末梢血からの無細胞胎児DNA分離に関するQIAAMP DSPウイルスキットとQIAAMP循環核酸キットの直接比較

背景：妊婦の血液には、非侵襲的出生前診断で広く使用されている細胞のない胎児DNA（CFFDNA）が含まれています。近代的な実験装置市場は、循環核酸の分離のための多種多様な商用キットを提供しますが、残念ながら、それらのどれもCffDNAの分離のために標準化されていません。これは、その後の分析の成功の重要なステップです。 目的：CFFDNA、セルフリーの総DNA（cftDNA）収率、および結果として生じるcffDNA画分、およびこれらのキットの有効性間の違いの可能性を説明しようとするという点で、DSPVKとCNAKを比較します。 方法：末梢血サンプルは、18人の健康な妊婦（妊娠6〜14週目）および12人の健康な妊娠中の被験者から収集されました。CftDNAは、各サンプルの1MLの血漿からQIAAMP循環核酸キット（CNAK）（Qiagen、ドイツ）およびQIAAMP DSPウイルスキット（DSPVK）（Qiagen、ドイツ）を使用して分離しました。メチル化感受性制限は、cffDNAを分離するために実施されました。cffDNAとcftDNAの収率は、デジタルPCRを使用して定量化されました。これら2つのキットの有効性の違いを説明するために、PCR阻害剤分析を実行し、DSPVKの最適な血漿入力を調査しました。 結果：CNAKを使用したCFFDNAの収量は、DSPVK（167.62（125.34-192.47）対52.88（35.48-125.42）GEQ/ml、P <0.001を使用するよりも統計的に有意に高かった。同じことがCftDNA収量にも当てはまり、CNAKはDSPVK（743.42（455.02-898.33）対371.07（294.37-509.89）GEQ/ML、P <0.001）より統計的に有意に優れているように見えます。CNAKを使用したCFFDNA画分は、DSVPK（24.75（14.5-31.53）対14.20（6.88-25.83）％、p = 0.586）を使用するよりも高かったが、DSPVKの結果がサンプルからサンプルまでの結果の不一致により統計的に有意ではなかった。PCR阻害剤分析では、DSPVKと比較して、CNAK CFTDNA溶液のPCR阻害剤の量の増加が明らかになりました（P = 0.002）。1MLを超えるDSPVKを使用したCftDNA抽出に0.5mLの血漿を使用すると、CftDNA出力がほぼ1.8倍高いことが示されています（P = 0.028）。 結論：CFFDNAの定量分析には、DSPVKよりもCNAKをお勧めします。それにもかかわらず、DSPVKは、CNAKのほぼ3倍安いため、定性分析と限られた予算の研究に間違いなく適しています。

BACKGROUND: Blood of pregnant women contains cell-free fetal DNA (cffDNA), which is widely used in non-invasive prenatal diagnosis. The modern laboratory equipment market provides huge variety of commercial kits for isolation of circulating nucleic acids, but unfortunately none of them are standardized for isolation of cffDNA, which is a crucial step for success of subsequent analysis. AIM: To compare DSPVK and CNAK in terms of cffDNA, cell-free total DNA (cftDNA) yield and resulting cffDNA fraction, as well as to try to explain the possible difference between the efficacy of these kits. METHODS: Peripheral blood samples were collected from 18 healthy pregnant women (6th-14th week of pregnancy) and from 12 healthy unpregnant subjects. cftDNA was isolated using QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (CNAK) (Qiagen, Germany) and QIAamp DSP Virus Kit (DSPVK) (Qiagen, Germany) from 1 ml of plasma of each sample. Methylation-sensitive restriction was carried out to isolate cffDNA. Yield of cffDNA and cftDNA was quantified using digital PCR. To explain the difference in resulting efficacy of these two kits PCR inhibitors analysis was performed, as well as the optimal plasma input for DSPVK was investigated. RESULTS: Yield of cffDNA using CNAK was statistically significantly higher than using DSPVK (167.62 (125.34-192.47) vs 52.88 (35.48-125.42) GEq/mL, p < 0.001). The same applies to cftDNA yield, CNAK appears to be statistically significantly superior to DSPVK (743.42 (455.02-898.33) vs 371.07 (294.37-509.89) GEq/mL, p < 0.001). cffDNA fraction using CNAK was also higher than using DSVPK (24.75 (14.5-31.53) vs 14.20 (6.88-25.83) %, p = 0.586), although the difference was not statistically significant due to inconsistency of DSPVK results from sample to sample. PCR inhibitors analysis uncovered increased amount of PCR inhibitors in CNAK cftDNA solution, compared to DSPVK (p = 0.002). Usage of 0.5 mL of plasma for cftDNA extraction with DSPVK over 1 mL demonstrates almost 1.8 times higher cftDNA output (p = 0.028), which suggests that this kit is not so viable for volumes of plasma larger than 0.5 mL. CONCLUSIONS: We recommend CNAK over DSPVK for quantitative analysis of cffDNA. Nevertheless, DSPVK is definitely suitable for qualitative analysis as well as for research with limited budget, since it is almost 3 times cheaper than CNAK.