原発性ヒトケラチノサイトおよび白血球からのタンパク質の高解像度抗体アレイ分析

標識プロテオームの抗体アレイ分析は、スループットが高く、実行が簡単ですが、検証は依然として困難です。ここでは、ヒトの原発性ケラチノサイトおよび白血球からのビオチン化タンパク質の高解像度分離のために、微分洗剤分別とサイズ除外クロマトグラフィーを順番に使用しました。各細胞型からの96のサンプル画分は、ミクロスフェアベースの抗体アレイとフローサイトメトリー（ミクロスフェアアフィニティプロテオミクス; MAP）で分析されました。サイトゾル、細胞質のオルガネラ、膜、核の単量子タンパク質と多分子複合体は、画分全体の抗体反応性の個別のピークとして分解されました。分別は、特異性を評価するための2次元マトリックスも提供しました。したがって、マトリックス内の位置がi）地下の位置、ii）意図されたターゲットのサイズ、およびIII）タンパク質発現の細胞型依存性変動と一致していた場合、抗体反応性ピークは特定の結合を表すと見なされました。同じタンパク質に対する異なる抗体または類似のタンパク質に対する抗体のいずれかの異なる抗体の反応性パターンの類似性が、追加のサポート証拠として使用されました。このアプローチは、数百のタンパク質の検証と単量体タンパク質とタンパク質複合体の同定を提供しました。高解像度マップは、固定化された抗体とタンパク質標識との特異性を得ることに関連する多くの問題を解決します。したがって、クロマトグラフィーとフローサイトメトリーにアクセスできる研究所は、毎日大規模なタンパク質分析を実行できます。これは、皮膚科学の細胞生物学研究と抗体の検証の新しい可能性を開きます。

Antibody array analysis of labeled proteomes has high throughput and is simple to perform, but validation remains challenging. Here, we used differential detergent fractionation and size exclusion chromatography in sequence for high-resolution separation of biotinylated proteins from human primary keratinocytes and leukocytes. Ninety-six sample fractions from each cell type were analyzed with microsphere-based antibody arrays and flow cytometry (microsphere affinity proteomics; MAP). Monomeric proteins and multi-molecular complexes in the cytosol, cytoplasmic organelles, membranes and nuclei were resolved as discrete peaks of antibody reactivity across the fractions. The fractionation also provided a two-dimensional matrix for assessment of specificity. Thus, antibody reactivity peaks were considered to represent specific binding if the position in the matrix was in agreement with published information about i) subcellular location, ii) size of the intended target, and iii) cell type-dependent variation in protein expression. Similarities in the reactivity patterns of either different antibodies to the same protein or antibodies to similar proteins were used as additional supporting evidence. This approach provided validation of several hundred proteins and identification of monomeric proteins and protein complexes. High-resolution MAP solves many of the problems associated with obtaining specificity with immobilized antibodies and a protein label. Thus, laboratories with access to chromatography and flow cytometry can perform large-scale protein analysis on a daily basis. This opens new possibilities for cell biology research in dermatology and validation of antibodies.