蛍光銅ナノクラスター（CUNCS）の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェーゼ支援形成に基づくウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）活性の感度検出

重要な塩基切除修復（BER）酵素として、ウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）は、ウラシル誘発性DNA病変を修復し、ゲノムの完全性を維持できます。本明細書では、端子デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TDT）に基づく敏感なUDGアッセイを提案し、蛍光銅ナノクラスター（CUNC）の形成を支援している。この研究では、ウラシルを含む幹ループDNA基質は、2 '、3'-ジドオキシシトシン（DDC）でブロックされた3'ENDで合理的に設計されています。UDGは、DNA基質のウラシルを除去して、アプリン/アピリミジン（AP）部位を生成できます。これは、エンドヌクレアーゼIV（ENDO IV）によって特異的に切断され、3'-OH末端を露出させることができます。TDTは、露出した3'-OH末端に沿ってテンプレートを含まないDNA伸長を開始して、非常に長いポリ（T）テールを生成し、蛍光cUNCの生産を完全にテンプレートします。CUNCの蛍光を記録することにより、UDG活性を忠実に検出できます。対照的に、UDGが存在しない場合、DNA基質の3'DDC末端はTDTによって認識できないため、CUNCのTDTベースの拡張と形成は発生しません。3 '末端ブロッカーとしてのDDCを使用すると、非特異的DNA拡張が大幅に減少し、信号対雑音比を改善できます。さらに、TDTはテンプレートフリーでシーケンス非依存性のDNAポリメラーゼであり、テールプロセスを最大数千のチミンまで効果的に触媒することができ、各尾は多くの蛍光cUNCを形成できます。したがって、超高感度が達成され、0.00005U/mLのUDGの低いことを明確に検出できます。さらに、TDTを介した拡張中に追加のAP部位で構成されたポリ（A）オリゴヌクレオチドが追加されているため、分岐増幅メカニズムも事前に考案され、UDGの検出限界を0.000002U/mlの非常に低いレベルにさらに押し込むことができます。

As an important base excision repair (BER) enzyme, uracil-DNA glycosylase (UDG) can repair the uracil-induced DNA lesion and maintain the genomic integrity. Herein, we have proposed a sensitive UDG assay based on the terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-assisted formation of fluorescent copper nanoclusters (CuNCs). In this study, a uracil-containing stem-loop DNA substrate is rationally designed with its 3'-end blocked with 2', 3'-dideoxycytosine (ddC). UDG can remove the uracil in the DNA substrate to generate an apurinic/apyrimidinic (AP) site, which can then be specifically cleaved by endonuclease IV (Endo IV) to expose a 3'-OH terminus. TdT will initiate the template-free DNA extension along the exposed 3'-OH terminus to produce a quite long poly(T) tail, which will perfectly template the production of fluorescent CuNCs. By recording the fluorescence of the CuNCs, the UDG activity can be faithfully detected. In contrast, if UDG is absent, the 3'-ddC terminus of the DNA substrate cannot be recognized by TdT and thus no TdT-based extension and formation of CuNCs will occur. The use of ddC as a 3'-end blocker can greatly decrease the nonspecific DNA extension and improve the signal-to-noise ratio. Furthermore, TdT is a template-free and sequence-independent DNA polymerase, which can effectively catalyze the tailing process up to a maximum of thousands of thymines, and each tail can form many fluorescent CuNCs. Therefore, an ultrahigh sensitivity is achieved and as low as 0.00005 U/mL of UDG can be clearly detected. Moreover, with an additional AP site-contained poly(A) oligonucleotide during TdT-mediated extension, a branched amplification mechanism is also preliminarily devised, which can further push the detection limit of UDG to an extremely low level of 0.000002 U/mL.