BRIF-seq：シングルセルレベルでのシーケンスシーケンスのビスル酸塩融合ランダムに統合されたフラグメント

単一細胞塩水シーケンス（SCBS-SEQ）は、ヒトおよびマウスのDNAメチル化不均一性を評価するために開発されました。ただし、これらの領域は通常、長いセグメントに断片化されており、イルミナプラットフォームでめったにシーケンスされることはめったにないため、読み取りは高DNAメチル化のある領域では過小表現されています。読み取り分布バイアスを削減し、これらの長いセグメントの使用を最大化するために、読み取りマッピングとゲノムカバレッジの高い割合の方法である、ビスライト変換ランダムに統合されたフラグメントシーケンス（BRIF-seq）を開発しました。高度にメチル化された繰り返しゲノムを備えたトウモロコシの単一のマイクロポアを使用して、BRIF-seqを実行しました。CG、CHG、およびCHH（H = A、C、またはT）のメチル化状態を評価するために、半数体ゲノムの高い被覆が得られました。SCBS-seqと比較して、BRIF-seqは、高DNAメチル化のある領域を含むゲノム全体でより均等に分布した読み取りを生成しました。驚くべきことに、1つの四肢帯内の4つの微小胞子のメチル化速度は類似していましたが、四四分体間では大幅に異なり、非同時のメチル化の再プログラミングが四字層間で発生する可能性があることを示唆しています。低コピー領域でしばしば発生する同様のレベルの不均一性は、異なる遺伝的背景で検出されました。これらの結果は、BRIF-seqを、多様な遺伝的背景を持つあらゆる種の単一細胞メチローム分析に適用できることを示唆しています。

Single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq) was developed to assess DNA methylation heterogeneity in human and mouse. However, the reads are under-represented in regions with high DNA methylation, because these regions are usually fragmented into long segments and are seldom sequenced on the Illumina platform. To reduce the read distribution bias and maximize the use of these long segments, we developed bisulfite-converted randomly integrated fragments sequencing (BRIF-seq), a method with high rates of read mapping and genome coverage. Single microspore of maize, which has a highly methylated and repetitive genome, was used to perform BRIF-seq. High coverage of the haploid genome was obtained to evaluate the methylation states of CG, CHG, and CHH (H = A, C, or T). Compared with scBS-seq, BRIF-seq produced reads that were distributed more evenly across the genome, including regions with high DNA methylation. Surprisingly, the methylation rates among the four microspores within one tetrad were similar, but differed significantly among tetrads, suggesting that non-simultaneous methylation reprogramming could occur among tetrads. Similar levels of heterogeneity, which often occur in low-copy regions, were detected in different genetic backgrounds. These results suggest that BRIF-seq can be applied for single-cell methylome analysis of any species with diverse genetic backgrounds.