ナノ粒子追跡解析を伴うヒト血液中の単一細胞外小胞の迅速な蛍光ベースの特性評価

エキソソームを含む細胞外小胞（EV）は、多くの細胞タイプから構成的に放出され、細胞間コミュニケーションと多様な生物学的プロセスの調節において極めて重要な役割を果たす身体液に見られる特殊な膜性ナノサイズの小胞です。EVの特性評価のための多くの異なる方法が説明されています。ただし、これらの方法のほとんどには、サンプルの準備と特性評価が非常に時間がかかるという不利な点があります。または、サイズが小さいため、個別の個体群の不足のために、興味のある特定のマーカーを分析することは非常に困難です。EVの分析の方法は過去10年間で大幅に改善されていますが、単一のEVの特性評価に関する標準化された方法はまだありません。ここでは、蛍光ベースのナノ粒子追跡解析による単一EVの特性評価のための半自動化方法を示します。提示されたプロトコルは、この分野の多くの研究者の一般的な問題に対処し、EVSの迅速な分離と一般的な細胞膜リンカー、およびCD63、CD9、ビメンチンなどの特定の表面マーカーとの特性評価のための完全なワークフローを提供します。、およびリソソーム関連膜タンパク質1（LAMP-1）。提示された結果は、ウエスタンブロッティングなどの他の方法で確認されているように、高いレベルの再現性を示しています。実施された実験では、ヒト血清サンプルから分離されたEVを独占的に使用しましたが、この方法は血漿または他の体液にも適しており、細胞培養上清からのEVの特性評価を調整できます。EV生物学に関する研究の将来の進歩に関係なく、ここで提示されるプロトコルは、特定のマーカーを使用した単一EVの迅速な特性評価のための迅速で信頼できる方法を提供します。

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.