MDM2へのp53結合に対するリン酸化の速度論的および熱力学的効果

p53は頻繁に人間の癌で変異しています。そのレベルは、E3ユビキチンリガーゼMDM2によって厳しく調節されています。MDM2とp53の間の複合体は、MDM2のN末端ドメインとp53のN末端トランス活性化（TA）ドメイン（残基15-29）の相互作用によって主に形成されます。TAドメインの野生型および変異体変異体を使用して、MDM2/P53相互作用の動力学的および熱力学的基礎を調査しました。リン膜模倣薬による置換を含む、Thr18およびSer20の位置でのリン酸化の効果に焦点を当てています。分離されたペプチドの立体構造的な傾向は、in silico法を使用して、および水溶液中の循環二色性と1H-NMRによって実験的に調査されました。実験分析と計算分析の両方は、P53ペプチドが主に水溶液で無秩序であり、Ser20-LEU25領域の周りの新生ヘリックスの証拠を示していることを示しています。Thr18でのリン酸化とリン酸和学の両方は、野生型と比較した場合、結合親和性の減少を10〜20倍減少させます。SER20でのリン酸化とリン酸剤は、親和性の減少が小さくなります。Lys24とLeu25の変異も相互作用を破壊します。私たちの結果は、MDM2/P53相互作用を標的とするペプチドベースの薬物のさらなる開発に役立つかもしれません。

p53 is frequently mutated in human cancers. Its levels are tightly regulated by the E3 ubiquitin ligase MDM2. The complex between MDM2 and p53 is largely formed by the interaction between the N-terminal domain of MDM2 and the N-terminal transactivation (TA) domain of p53 (residues 15-29). We investigated the kinetic and thermodynamic basis of the MDM2/p53 interaction by using wild-type and mutant variants of the TA domain. We focus on the effects of phosphorylation at positions Thr18 and Ser20 including their substitution with phosphomimetics. Conformational propensities of the isolated peptides were investigated using in silico methods and experimentally by circular dichroism and 1H-NMR in aqueous solution. Both experimental and computational analyses indicate that the p53 peptides are mainly disordered in aqueous solution, with evidence of nascent helix around the Ser20-Leu25 region. Both phosphorylation and the phosphomimetics at Thr18 result in a decrease in the binding affinity by ten- to twenty-fold when compared to the wild-type. Phosphorylation and phosphomimetics at Ser20 result in a smaller decrease in the affinity. Mutation of Lys24 and Leu25 also disrupts the interaction. Our results may be useful for further development of peptide-based drugs targeting the MDM2/p53 interaction.