蛍光タンパク質を使用した哺乳類細胞の相関クライオスーパー分解光と電子顕微鏡

硝化によるサンプル固定は、生体分子の最適な構造的保存と、極低温および電子顕微鏡（CRYOCLEM）によるその後の高解像度イメージングにとって重要です。Cryo蛍光顕微鏡検査（CRYOFLM）、〜400-nm、およびクライオエレクトロン顕微鏡（CRYOEM）で達成可能なサブナノメートルの解像度の間には大きな解像度ギャップがあり、クライクレムデータの解釈を妨げます。ここでは、同じ領域での連続したCRYOEM調査と互換性のあるCryo-Super解像度（CRYOSR）顕微鏡を使用して、cryofLMの解像度を増やすための一般的なアプローチを提示します。凍結防止剤を必要とせずに凍結アンプルの編集を避けるために、画像診断パラメーターを決定しました。次に、単一分子局在CRYOSR顕微鏡検査に対するさまざまな蛍光タンパク質（FPS）の適用可能性を調べ、調査したすべてのFPSが可逆的な写真スイッチスイッチ可能な挙動を示すことを発見し、RSEGFP2およびrsafstlimeで標識された脂質ナノチューブ上のcryOSRを実証しました。最後に、RSEGFP2に融合した微小管関連タンパク質-2を発現する哺乳類細胞でSR-クリオクレムを実行し、局所的な領域で3Dクライオエレクトロン断層撮影を実施しました。この方法では、市販の機器のみを使用して、30 nmのローカリゼーション精度を実現します。さらに、調査対象のすべてのFPSは、cryOSR顕微鏡と互換性のある行動を示し、この手法を特殊な機器を必要とせずに広く利用できるようにし、細胞および構造生物学のこの新たな手法の適用性を改善します。

Sample fixation by vitrification is critical for the optimal structural preservation of biomolecules and subsequent high-resolution imaging by cryo-correlative light and electron microscopy (cryoCLEM). There is a large resolution gap between cryo fluorescence microscopy (cryoFLM), ~400-nm, and the sub-nanometre resolution achievable with cryo-electron microscopy (cryoEM), which hinders interpretation of cryoCLEM data. Here, we present a general approach to increase the resolution of cryoFLM using cryo-super-resolution (cryoSR) microscopy that is compatible with successive cryoEM investigation in the same region. We determined imaging parameters to avoid devitrification of the cryosamples without the necessity for cryoprotectants. Next, we examined the applicability of various fluorescent proteins (FPs) for single-molecule localisation cryoSR microscopy and found that all investigated FPs display reversible photoswitchable behaviour, and demonstrated cryoSR on lipid nanotubes labelled with rsEGFP2 and rsFastLime. Finally, we performed SR-cryoCLEM on mammalian cells expressing microtubule-associated protein-2 fused to rsEGFP2 and performed 3D cryo-electron tomography on the localised areas. The method we describe exclusively uses commercially available equipment to achieve a localisation precision of 30-nm. Furthermore, all investigated FPs displayed behaviour compatible with cryoSR microscopy, making this technique broadly available without requiring specialised equipment and will improve the applicability of this emerging technique for cellular and structural biology.