CRISPR-CAS9D10A溶媒生産者Clostridium beijerinckiiでのNickase-Assistedベース編集

Clostridium beijerinckiiは、さまざまな炭素源から貴重な化学物質や燃料を合成できるため、潜在的に重要な産業微生物です。使用するのに便利な確立は、生物を迅速に修正できる効果的な遺伝子ツールが不可欠です。ここでは、シチジンデアミナーゼ（APOBEC1）、CAS9 D10Aニッカーゼ、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）の融合に基づいて、C。beijerinckiiで使用するためのゲノム編集ツール（PCBECLOS）を開発しました。APOBEC1とUGIは、C・GからT・Aへの変換を通じて特定の基本ペア置換を導入するターゲットサイトに導かれます。標的配列を適切に選択することにより、これらのヌクレオチドの変化は、遺伝子にミスセンス変異またはヌル変異を作成することができます。PCBECLOSの最適化により、システム由来のPCBECLOS-OPTは、C。beijerinckii、Pyre、Xylr、Spo0a、およびArarの4つの異なる変異体を迅速に生成するために使用されています。システムの効率性は、変換後に直接取得することがあり、それ以外の場合は1つの抑制ステップのみを必要とすることがありました。PnickClos2.0などのCRISPR-CAS9 Nickaseシステムは以前にC. beijerinckiiで報告されていますが、Pcbeclos-Optは、C。beijerinckiiなどのクロストリジアでは本質的に非効率的なプロセスである相同組換えに依存していません。結果として、かさばる編集テンプレートをノックアウトプラスミドに含める必要はありません。これにより、プラスミドのサイズが縮小され、たとえばPnickClos2.0のアセンブリが典型的なノックアウトプラスミドのアセンブリに6つのプライマーを必要とする場合、PCBECLOS-OPTは2つのプライマーのみを必要とします。ここで確立されたPCBECLOS-OPTプラスミドは、C。beijerinckiiのゲノム編集のための強力な新しいツールを表しています。

Clostridium beijerinckii is a potentially important industrial microorganism as it can synthesize valuable chemicals and fuels from various carbon sources. The establishment of convenient to use, effective gene tools with which the organism can be rapidly modified is essential if its full potential is to be realized. Here, we developed a genomic editing tool (pCBEclos) for use in C. beijerinckii based on the fusion of cytidine deaminase (Apobec1), Cas9 D10A nickase and uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI). Apobec1 and UGI are guided to the target site where they introduce specific base-pair substitutions through the conversion of C·G to T·A. By appropriate choice of target sequence, these nucleotide changes are capable of creating missense mutation or null mutations in a gene. Through optimization of pCBEclos, the system derived, pCBEclos-opt, has been used to rapidly generate four different mutants in C. beijerinckii, in pyrE, xylR, spo0A, and araR. The efficiency of the system was such that they could sometimes be directly obtained following transformation, otherwise only requiring one single restreaking step. Whilst CRISPR-Cas9 nickase systems, such as pNICKclos2.0, have previously been reported in C. beijerinckii, pCBEclos-opt does not rely on homologous recombination, a process that is intrinsically inefficient in clostridia such as C. beijerinckii. As a consequence, bulky editing templates do not need to be included in the knockout plasmids. This both reduces plasmid size and makes their construction simpler, for example, whereas the assembly of pNICKclos2.0 requires six primers for the assembly of a typical knockout plasmid, pCBEclos-opt requires just two primers. The pCBEclos-opt plasmid established here represents a powerful new tool for genome editing in C. beijerinckii, which should be readily applicable to other clostridial species.