ユビキチン様修飾子fat10による修飾とタンパク質分解ターゲティングの分析

ユビキチン様修飾因子FAT10（ユビキチンD（UBD）とも呼ばれます）は、かなりの数のタンパク質と非共有相互作用し、多くの基質タンパク質に共有結合し、26Sプロテアソームによる分解につながります。FAT10は、柔軟なリンカーで接続されている2つのゆるく折りたたまれたユビキチン様ドメインで構成されており、この珍しい構造により、凝集が非常に発生しやすくなります。ここでは、in vitro Fat10ylation Assaysなどのさまざまな用途のために、大量の可溶性組換えFAT10を精製する方法を報告します。さらに、免疫沈降、ウエスタンブロット分析、およびFAT10分解研究で使用するために、セルロの内因性FAT10と同様に、過剰発現し、内因性FAT10を生成および処理する方法について説明します。

The ubiquitin-like modifier FAT10 (also called ubiquitin D (UBD)) interacts noncovalently with a substantial number of proteins and also gets covalently conjugated to many substrate proteins, leading to their degradation by the 26S proteasome. FAT10 comprises two loosely folded ubiquitin-like domains that are connected by a flexible linker, and this unusual structure makes it highly prone to aggregation. Here, we report methods to purify high amounts of soluble recombinant FAT10 for various uses, such as in vitro FAT10ylation assays. In addition, we describe how to generate and handle overexpressed as well as endogenous FAT10 in cellulo for use in immunoprecipitations, Western blot analyses, and FAT10 degradation studies.