マイトファジーは、筋芽細胞の分化中にミトコンドリアネットワークシグナル伝達、酸化ストレス、アポトーシスを調節します

マクロオートファジー/オートファジーは、さまざまな細胞プロセスに不可欠な分解プロセスです。我々は以前、オートファジー欠損が筋芽細胞のアポトーシスを引き起こし、筋管形成を損なうことを実証しました。この研究では、ミトコンドリアのリモデリングとストレス/アポトーシスシグナル伝達に特に重点を置いて研究を続けました。我々は、筋芽細胞分化中にオートファジーシグナル伝達（例、LC3Bレベルの変化、ATG7増加、SQSTM1減少）およびマイトファジーシグナル伝達（例、BNIP3アップレギュレーション、ミトコンドリア局在GFP-LC3涙点、ミトコンドリアLC3B-II上昇）の増加（p < 0.05）を発見した。 shRNA を介した ATG7 のノックダウン (shAtg7) は、これらのオートファジー応答とマイトファジー応答を減少させる一方で、分化中の筋芽細胞における CASP3 活性と ANXA5/アネキシン V 染色を増加させました。最終的には筋形成が著しく損なわれることになります。これらの応答におけるマイトファジーの重要性をさらに確認するため、CRISPR-Cas9 を介した Bnip3 のノックアウト (bnip3-/-) により、CASP3 活性と DNA 断片化が増加し、筋芽細胞の分化が障害されました。さらに、shAtg7 筋芽細胞は、より大きな小胞体ストレス (例、CAPN 活性および HSPA の増加) およびミトコンドリアストレス (例、mPTP 形成、ミトコンドリア膜電位の低下、ミトコンドリア 4-HNE の上昇) を示しました。 shAtg7 および bnip3-/- 筋芽細胞も、ミトコンドリア関連シグナル伝達 (例、PPARGC1A、DNM1L、OPA1) およびタンパク質含量 (例、SLC25A4、VDAC1、CYCS) の変化を示しました。さらに、shAtg7 筋芽細胞は、ミトコンドリアからの CYCS および AIFM1 の放出、および CASP9 の活性化を示しました。同様に、bnip3-/- 筋芽細胞は分化中に CASP9 活性化が著しく高かった。重要なことに、CASP9 (Ac-LEHD-CHO) またはドミナントネガティブ CASP9 (ad-DNCASP9) の化学阻害剤の投与により、shAtg7 筋芽細胞の分化と筋形成が部分的に回復しました。これらのデータを総合すると、オートファジーが分化中のミトコンドリアの酸化ストレスやアポトーシスシグナル伝達から筋芽細胞を保護すること、さらにはミトコンドリアネットワークのリモデリングや筋形成の調節において、オートファジーが重要な役割を果たしていることが実証される。略語: 3MA: 3-メチルアデニン。 4-HNE: 4-ヒドロキシノネナール; ACT：アクチン。 AIFM1/AIF: アポトーシス誘導因子、ミトコンドリア関連 1。 ANXA5: アネキシン V; ATG7: オートファジー関連 7; AU: 任意の単位。 BAX: BCL2 関連 X タンパク質。 BCL2: B細胞白血病/リンパ腫2; BECN1: ベクリン 1、オートファジー関連。 BNIP3: BCL2/アデノウイルス E1B 相互作用タンパク質 3; CAPN: カルパイン; CASP: カスパーゼ; CASP3: カスパーゼ 3; CASP8: カスパーゼ 8; CASP9: カスパーゼ 9; CASP12: カスパーゼ 12; CAT: カタラーゼ。 CQ: クロロキン。 CYCS: シトクロム c、体細胞。 DCF; 2',7'-ジクロロフルオレセイン; DNM1L/DRP1: ダイナミン 1 様。 DM: 分化培地。 DMEM: ダルベッコ改変イーグル培地。 ER: 小胞体。 GAPDH: グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。 GFP:緑色蛍光タンパク質。 GM: 増殖培地。 p-H2AFX: リン酸化 H2A ヒストン ファミリー、メンバー X。 H2BFM: H2B ヒストンファミリー、メンバー M。 HBSS: ハンクス平衡塩類溶液。 HSPA/HSP70: 熱ショックタンパク質ファミリー A。 JC-1: テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド; MAP1LC3B/LC3B: 微小管関連タンパク質 1 軽鎖 3 ベータ。 mPTP: ミトコンドリア透過性遷移孔。 MYH: ミオシン重鎖。 MYOG：ミオゲニン。 OPA1: OPA1、GTPase のようなミトコンドリア ダイナミン。 PI: ヨウ化プロピジウム。 PINK1: PTEN は推定上のキナーゼ 1 を誘導します。 PPARGC1A/PGC1α: ペルオキシソーム増殖活性化受容体、ガンマ、コアクチベーター 1 アルファ。 ROS: 活性酸素種。 SLC25A4/ANT1: 溶質キャリアファミリー 25 (ミトコンドリアキャリア、アデニンヌクレオチドトランスロケーター)、メンバー 4。 SOD1: スーパーオキシドジスムターゼ 1、可溶性。 SOD2: スーパーオキシドジスムターゼ 2、ミトコンドリア。 SQSTM1/p62: セクエストソーム 1; VDAC1: 電圧依存性アニオン チャネル 1。

Macroautophagy/autophagy is a degradative process essential for various cellular processes. We previously demonstrated that autophagy-deficiency causes myoblast apoptosis and impairs myotube formation. In this study, we continued this work with particular emphasis on mitochondrial remodelling and stress/apoptotic signaling. We found increased (p < 0.05) autophagic (e.g., altered LC3B levels, increased ATG7, decreased SQSTM1) and mitophagic (e.g., BNIP3 upregulation, mitochondrial localized GFP-LC3 puncta, and elevated mitochondrial LC3B-II) signaling during myoblast differentiation. shRNA-mediated knockdown of ATG7 (shAtg7) decreased these autophagic and mitophagic responses, while increasing CASP3 activity and ANXA5/annexin V staining in differentiating myoblasts; ultimately resulting in dramatically impaired myogenesis. Further confirming the importance of mitophagy in these responses, CRISPR-Cas9-mediated knockout of Bnip3 (bnip3-/-) resulted in increased CASP3 activity and DNA fragmentation as well as impaired myoblast differentiation. In addition, shAtg7 myoblasts displayed greater endoplasmic reticulum (e.g., increased CAPN activity and HSPA) and mitochondrial (e.g., mPTP formation, reduced mitochondrial membrane potential, elevated mitochondrial 4-HNE) stress. shAtg7 and bnip3-/- myoblasts also displayed altered mitochondria-associated signaling (e.g., PPARGC1A, DNM1L, OPA1) and protein content (e.g., SLC25A4, VDAC1, CYCS). Moreover, shAtg7 myoblasts displayed CYCS and AIFM1 release from mitochondria, and CASP9 activation. Similarly, bnip3-/- myoblasts had significantly higher CASP9 activation during differentiation. Importantly, administration of a chemical inhibitor of CASP9 (Ac-LEHD-CHO) or dominant-negative CASP9 (ad-DNCASP9) partially recovered differentiation and myogenesis in shAtg7 myoblasts. Together, these data demonstrate an essential role for autophagy in protecting myoblasts from mitochondrial oxidative stress and apoptotic signaling during differentiation, as well as in the regulation of mitochondrial network remodelling and myogenesis. Abbreviations: 3MA: 3-methyladenine; 4-HNE: 4-hydroxynonenal; ACT: actin; AIFM1/AIF: apoptosis-inducing factor, mitochondrion-associated 1; ANXA5: annexin V; ATG7: autophagy related 7; AU: arbitrary units; BAX: BCL2-associated X protein; BCL2: B cell leukemia/lymphoma 2; BECN1: beclin 1, autophagy related; BNIP3: BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3; CAPN: calpain; CASP: caspase; CASP3: caspase 3; CASP8: caspase 8; CASP9: caspase 9; CASP12: caspase 12; CAT: catalase; CQ: chloroquine; CYCS: cytochrome c, somatic; DCF; 2',7'-dichlorofluorescein; DNM1L/DRP1: dynamin 1-like; DM: differentiation media; DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium; ER: endoplasmic reticulum; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GFP: green fluorescent protein; GM: growth media; p-H2AFX: phosphorylated H2A histone family, member X; H2BFM: H2B histone family, member M; HBSS: Hanks balanced salt solution; HSPA/HSP70: heat shock protein family A; JC-1: tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide; MAP1LC3B/LC3B: microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta; mPTP: mitochondrial permeability transition pore; MYH: myosin heavy chain; MYOG: myogenin; OPA1: OPA1, mitochondrial dynamin like GTPase; PI: propidium iodide; PINK1: PTEN induced putative kinase 1; PPARGC1A/PGC1α: peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha; ROS: reactive oxygen species; SLC25A4/ANT1: solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, adenine nucleotide translocator), member 4; SOD1: superoxide dismutase 1, soluble; SOD2: superoxide dismutase 2, mitochondrial; SQSTM1/p62: sequestosome 1; VDAC1: voltage-dependent anion channel 1.