Ni（II）Cleavable C末端ヘキサヒスチジン親和性タグを使用したネイティブ末端配列によるタンパク質の精製

タンパク質配列の末端の役割は、親和性タグの特定のプロテアーゼ切断後、および/または遺伝子の挿入に使用される制限酵素部位の/周りにプラスミドによってコードされたアミノ酸によってエンコードされたアミノ酸によって、残ったアミノ酸によって摂動されることがよくあります。ここでは、メタロンヌクレアーゼのアフィニティ精製の方法を正確に決定したネイティブ末端を説明します。まず、標的タンパク質をコードする遺伝子は、新しく設計されたクローニング部位に挿入され、2つの自己誘発BSMBI制限酵素部位が含まれています。結果として、Ni（II）感受性Ser-X-HIS-Xモチーフの設計されたDNAコードは、挿入された遺伝子の3 '末端に融合し、その後タンパク質精製目的のための親和性タグの遺伝子が融合します。上記のSERから始まるC末端セグメントは、Ni（II）誘導プロテアーゼ様作用によって精製されたタンパク質から切断されます。精製と切断の成功は、ゲル電気泳動と質量分析によって確認され、精製タンパク質の構造的完全性は循環二色性分光法によってチェックされました。私たちの新しいタンパク質発現DNA構築物は、アミノ酸残基が残っていないアフィニティまたは他のタグの完全な除去が不可欠な場合、タンパク質精製の有利なツールです。説明された手順は、クロマトグラフィーアプリケーションのC末端でさまざまなアフィニティタグと簡単に一般化して組み合わせることができます。

The role of the termini of protein sequences is often perturbed by remnant amino acids after the specific protease cleavage of the affinity tags and/or by the amino acids encoded by the plasmid at/around the restriction enzyme sites used to insert the genes. Here we describe a method for affinity purification of a metallonuclease with its precisely determined native termini. First, the gene encoding the target protein is inserted into a newly designed cloning site, which contains two self-eliminating BsmBI restriction enzyme sites. As a consequence, the engineered DNA code of Ni(II)-sensitive Ser-X-His-X motif is fused to the 3'-end of the inserted gene followed by the gene of an affinity tag for protein purification purpose. The C-terminal segment starting from Ser mentioned above is cleaved off from purified protein by a Ni(II)-induced protease-like action. The success of the purification and cleavage was confirmed by gel electrophoresis and mass spectrometry, while structural integrity of the purified protein was checked by circular dichroism spectroscopy. Our new protein expression DNA construct is an advantageous tool for protein purification, when the complete removal of affinity or other tags, without any remaining amino acid residue is essential. The described procedure can easily be generalized and combined with various affinity tags at the C-terminus for chromatographic applications.