コロナウイルス温度感受性変異体の分析は、複製と病因に影響を与えるマクロドメインとパパイン様プロテアーゼとの相互作用を明らかにしています

温度感受性（TS）変異体ウイルスの分析は、研究者がウイルスの複製と病因に関与する遺伝子遺伝子座を特定できるようにする古典的な方法です。ここでは、マクロドメイン（MAC）およびパパイン様プロテアーゼ2（PLP2）の非構造タンパク質3（NSP3）のドメインにおける変異の役割に焦点を当てたマウス肝炎ウイルス（MHV）、TSNC11のTS株の遺伝分析を報告します。、ウイルス複製複合体のコンポーネント。MHV逆遺伝学を使用して、一連の変異ウイルスを生成して、TS表現型へのマクロドメインおよびPLP2特異的変異の寄与を定義しました。寛容な温度および非容疑者の温度で実行されたウイルス複製速度論とプレートの効率分析により、マクロドメインだけの変化がTS表現型に必要かつ十分であることが明らかになりました。興味深いことに、PLP2ドメインの変異は温度感度の原因ではありませんでしたが、マクロドメイン変異体の復帰頻度を減らしました。共免疫沈降研究は、マクロドメインとPLP2の間の相互作用と一致しています。NSP3のマクロドメイン-PLP2部分の発現研究は、TS変異がタンパク質のプロテアソーム媒介分解を促進することを示しています。さらに、ウイルス感染中に、MACおよびPLP2変異を含むレプリカーゼタンパク質は、野生型タンパク質よりも非検察温度でより急速に分解されることがわかりました。重要なことに、マクロドメインおよびPLP2変異体ウイルスがin vitroでI型インターフェロンの産生を引き起こし、マウスで減衰し、ウイルス病因におけるマクロドメイン-PLP2相互作用の重要性をさらに強調していることを示しています。パンデミックの可能性があります。確立され予測された脅威にもかかわらず、これらのウイルスは人間の健康にもたらされますが、現在、人間のこれらのウイルスで感染を制御するための承認された対策はありません。ウイルスマクロドメイン、タンパク質の翻訳後ADPリボシル化を除去する酵素、およびウイルス性多機能パパイン様プロテアーゼ、ポリタンパク質を切断し、脱ユビキチン化活性を介してポリビキチン鎖を除去する酵素は、2つの重要なウイルス因子です。ここでは、マクロドメインとPLP2ドメインとの間の予期せぬ相互作用を明らかにし、宿主の自然免疫応答に複製して拮抗するために重要です。これらの酵素の相互作用を標的とすることで、COV疾患を治療する新しい治療機会が提供される場合があります。

Analysis of temperature-sensitive (ts) mutant viruses is a classic method allowing researchers to identify genetic loci involved in viral replication and pathogenesis. Here, we report genetic analysis of a ts strain of mouse hepatitis virus (MHV), tsNC11, focusing on the role of mutations in the macrodomain (MAC) and the papain-like protease 2 (PLP2) domain of nonstructural protein 3 (nsp3), a component of the viral replication complex. Using MHV reverse genetics, we generated a series of mutant viruses to define the contributions of macrodomain- and PLP2-specific mutations to the ts phenotype. Viral replication kinetics and efficiency-of-plating analysis performed at permissive and nonpermissive temperatures revealed that changes in the macrodomain alone were both necessary and sufficient for the ts phenotype. Interestingly, mutations in the PLP2 domain were not responsible for the temperature sensitivity but did reduce the frequency of reversion of macrodomain mutants. Coimmunoprecipitation studies are consistent with an interaction between the macrodomain and PLP2. Expression studies of the macrodomain-PLP2 portion of nsp3 indicate that the ts mutations enhance proteasome-mediated degradation of the protein. Furthermore, we found that during virus infection, the replicase proteins containing the MAC and PLP2 mutations were more rapidly degraded at the nonpermissive temperature than were the wild-type proteins. Importantly, we show that the macrodomain and PLP2 mutant viruses trigger production of type I interferon in vitro and are attenuated in mice, further highlighting the importance of the macrodomain-PLP2 interplay in viral pathogenesis.IMPORTANCE Coronaviruses (CoVs) are emerging human and veterinary pathogens with pandemic potential. Despite the established and predicted threat these viruses pose to human health, there are currently no approved countermeasures to control infections with these viruses in humans. Viral macrodomains, enzymes that remove posttranslational ADP-ribosylation of proteins, and viral multifunctional papain-like proteases, enzymes that cleave polyproteins and remove polyubiquitin chains via deubiquitinating activity, are two important virulence factors. Here, we reveal an unanticipated interplay between the macrodomain and the PLP2 domain that is important for replication and antagonizing the host innate immune response. Targeting the interaction of these enzymes may provide new therapeutic opportunities to treat CoV disease.