in vitroで転写されたmRNAからdsRNA汚染物質を除去するための容易な方法

in vivoでエンコードされた治療タンパク質を合成するためのin vitro転写された（IVT）mRNAの重要性の増加には、純粋なmRNA産物の製造が必要です。IVT mRNAの主要な汚染物質は二本鎖RNA（DSRNA）であり、特別な計装と危険廃棄物を生成する必要がある負担の多い手順によってのみ除去できる転写副産物です。ここでは、標準的な実験室の技術のみを含む、代替、高速、費用対効果の高い方法を提示します。IVT mRNAの精製は、エタノール含有バッファー内のdsRNAのセルロースへの選択的結合に基づいています。DSRNA汚染物質の少なくとも90％が、IVT mRNAの長さ、コーディングシーケンス、およびヌクレオシド組成に関係なく、65％を超える回復率で除去できることを実証します。手順はスケーラブルです。マイクログラムまたはミリグラム量のIVT mRNAの精製が達成可能です。マウスにおけるin vivoでのmRNA精製の影響を評価すると、1-メチルプソリジン含有IVT mRNAを含む投与された転写産物について、翻訳の増加を測定できます。dsRNA汚染物質のセルロースベースの除去は、in vivoアプリケーションに適した非常に純粋なIVT mRNAを取得するための効果的で信頼性が高く、安全な方法です。

The increasing importance of in vitro-transcribed (IVT) mRNA for synthesizing the encoded therapeutic protein in vivo demands the manufacturing of pure mRNA products. The major contaminant in the IVT mRNA is double-stranded RNA (dsRNA), a transcriptional by-product that can be removed only by burdensome procedure requiring special instrumentation and generating hazardous waste. Here we present an alternative simple, fast, and cost-effective method involving only standard laboratory techniques. The purification of IVT mRNA is based on the selective binding of dsRNA to cellulose in an ethanol-containing buffer. We demonstrate that at least 90% of the dsRNA contaminants can be removed with a good, >65% recovery rate, regardless of the length, coding sequence, and nucleoside composition of the IVT mRNA. The procedure is scalable; purification of microgram or milligram amounts of IVT mRNA is achievable. Evaluating the impact of the mRNA purification in vivo in mice, increased translation could be measured for the administered transcripts, including the 1-methylpseudouridine-containing IVT mRNA, which no longer induced interferon (IFN)-α. The cellulose-based removal of dsRNA contaminants is an effective, reliable, and safe method to obtain highly pure IVT mRNA suitable for in vivo applications.