発生中のプリプロラクチンのシグナル配列の光分類シグナル認識粒子の54キロダルトンポリペプチドへ

光反応性部分は、プラスミド由来のプリプロラクチンmRNAおよびlys-trNAアナログ、n epsilon-（5-アジド-2-ニトロベンゾイル）-lys-tRNA（epsilon anb--を使用して、小麦生殖タンパク質合成システムの新生時ポリペプチドに組み込まれました。lys-trna）。初期鎖における異常に大きなアミノ酸側鎖の存在は機能を損なわなかった：シグナル認識粒子（SRP）の非存在下で完全なプリプロラクチン鎖が合成され、SRPの存在下で伸長が阻害され、SRP依存性転座が阻害された小胞体およびシグナルペプチダーゼ切断の膜を横切って、塩吸収ミクロソームの存在下で観察されました。伸長リボソームの光分解により、いくつかの光およびイプシロンのanb-lys-trNA依存性架橋が生じました。各タンパク質に特異的な抗体を使用することにより、1つの共有結合複合体は、プリプロラクチン新生鎖とSRPの54-kDAタンパク質サブユニットとの間の光閉鎖式であることが示されました。これは、分泌タンパク質のN末端末端が伸長リボソームのSRPに隣接して配置されていることを示しており、SRPの54 kDaサブユニットによって信号配列が認識され、結合することを強く示唆しています。他のPhotocrosslinksには、大規模なリボソームサブユニットのまだまだ正当化されたタンパク質が含まれ、プローブを組み込むこの方法は、小胞体の膜を横切る翻訳と転座中の新生鎖の環境と相互作用を調べるための強力なアプローチを提供することを示しています。Lys-TRNAアナログはまた、Epsilon anb-Lys-trna.ef-tu.gtp三元複合体の大腸菌伸長因子Tu（EF-TU）を光アフィニティに標識しました。

Photoreactive moieties were incorporated into nascent polypeptides in a wheat germ protein-synthesizing system by using a plasmid-derived preprolactin mRNA and a Lys-tRNA analog, N epsilon-(5-azido-2-nitrobenzoyl)-Lys-tRNA (epsilon ANB-Lys-tRNA). The presence of the abnormally large amino acid side chains in the nascent chains did not impair function: complete preprolactin chains were synthesized in the absence of the signal recognition particle (SRP), elongation was arrested in the presence of SRP, and SRP-dependent translocation across the membrane of the endoplasmic reticulum and signal peptidase cleavage were observed in the presence of salt-extracted microsomes. Photolysis of elongation-arrested ribosomes resulted in several light- and epsilon ANB-Lys-tRNA-dependent crosslinks. By using antibodies specific for each of the proteins, one covalent complex was shown to be a photocrosslink between the preprolactin nascent chain and the 54-kDa protein subunit of SRP. This demonstrates that the N-terminal end of a secretory protein is located adjacent to the SRP in elongation-arrested ribosomes and strongly suggests that the signal sequence is recognized by and binds to the 54-kDa subunit of SRP. The other photocrosslinks involve as-yet-unidentified proteins in the large ribosomal subunit, indicating that this method of incorporating probes provides a powerful approach to examining the environment and interactions of the nascent chain during translation and translocation across the membrane of the endoplasmic reticulum. The Lys-tRNA analog also successfully photoaffinity-labeled the Escherichia coli elongation factor Tu (EF-Tu) in the epsilon ANB-Lys-tRNA.EF-Tu.GTP ternary complex.