大腸菌の低コピー数ベクターを使用した亜種の新規遺伝子銀行の建設

低コピー数ベクタープラスミドPCT571を構築して、大腸菌の亜種のゲノム断片をクローンしました。PCT571は、大腸菌のKMR、TCR、およびCMRをB. subtilisのCMRに付与します。KMRおよびTCRマーカー内に独自の制限部位があり、これらの遺伝子の挿入不活性化により組換えプラスミドのスクリーニングを可能にします。PSC101レプリコンが含まれており、通常、大腸菌の染色体同等物ごとに6〜8コピーで複製します。また、ORIVRK2が含まれています。ORIVRK2には、TRANSのRK2のTRFA遺伝子の積が供給されると、PCT571が染色体当量あたり35〜40コピーで複製できます。B. subtilis遺伝子銀行は、B。subtilis染色体DNAの部分的にSAU3aが消化し、サイズに拡張された断片をPCT571のBamHI部位にクローニングすることにより作成されました。1097 KMR TCS形質転換体のDNAを抽出し、電気泳動的にSuper -Coiled DNAとして分析し、EcoriまたはEcoriおよびSaliで消化した後に分析しました。合理的なサイズのB. subtilisフラグメントで約1000のハイブリッドプラスミドが見つかりました。PCT571のインサートの平均サイズは8 kbで、異なるプラスミドでは4〜20 kbの範囲です。遺伝子バンクは、大腸菌およびB. subtilisの選択可能な栄養マーカーについて遺伝子バンクのスクリーニングの結果で示されているように、B。subtilis染色体のほとんどをカバーしています。ARG、HIS、LYS、MET、PDX、PYR、およびTHRマーカーのために大腸菌変異体を補完するハイブリッドプラスミドが遺伝子バンクから識別されました。B. subtilisでは、argc、cysa、dal、hisa、ilva、leua、lys、metb、metc、phe、pura、purb、purb、trpcの存在が変換実験によって確立されました。細菌株のクローニングおよび長期維持に対するコピー数の影響も調査されました。高いコピー数では、いくつかのハイブリッドプラスミドをまったく維持できませんが、他のハイブリッドプラスミドは構造的削除と再配置の速度が増加することを示します。

Low copy number vector plasmid pCT571 was constructed to clone Bacillus subtilis genomic fragments in Escherichia coli. pCT571 confers KmR, TcR and CmR in E. coli and CmR in B. subtilis. It has unique restriction sites within the KmR and TcR markers to allow screening for recombinant plasmids by insertional inactivation of these genes. It contains the pSC101 replicon and replicates normally at six to eight copies per chromosome equivalent in E. coli. It also contains oriVRK2, which when supplied with the product of the trfA gene of RK2 in trans, allows pCT571 to replicate at 35-40 copies per chromosome equivalent. A B. subtilis gene bank was created by cloning partially Sau3A-digested and size-fractionated fragments of B. subtilis chromosomal DNA into the BamHI site of pCT571. DNA from 1097 KmR TcS transformants was extracted and analysed electrophoretically as supercoiled DNA and after digesting with EcoRI or EcoRI and SalI. Approximately 1000 hybrid plasmids were found with reasonably sized B. subtilis fragments. The mean size of the inserts in pCT571 is 8 kb, ranging from 4 to 20 kb in different plasmids. The gene bank covers most of the B. subtilis chromosome, as demonstrated by the results of screening the gene bank for selectable nutritional markers in E. coli and B. subtilis. Hybrid plasmids which complement E. coli mutants for arg, his, lys, met, pdx, pyr and thr markers were identified from the gene bank. In B. subtilis the presence of argC, cysA, dal, hisA, ilvA, leuA, lys, metB, metC, phe, purA, purB, thr and trpC was established by transformation experiments. The effects of copy number on cloning and long-term maintenance in the bacterial strains were also investigated. At high copy number some hybrid plasmids cannot be maintained at all, while others show an increased rate of structural deletions and rearrangements.