分解阻害剤オーキシノールを使用して、条件付きオーキシン誘導性デグロン（AID）細胞とデグロン融合タンパク質の緊密な制御の生成

関心のあるタンパク質が可逆的に急速に枯渇する可能性があるため、デグロンを使用してタンパク質発現を制御することは有利です。植物固有の分解経路を非植物細胞に移植することにより、オーキシン誘導性デグロン（AID）技術の開発を開拓しました。E3リガーゼ成分であるOSTIR1を発現するヒト細胞では、植物ホルモンオーキシンの存在下で15〜45分の半減期を持つ脱gron融合タンパク質を分解することができます。以前に、内因性タンパク質のC末端がCRISPR-CAS9ベースのノックインによってデグロンと融合されたヒトHCT116変異体の生成を報告しました。ここでは、N末端タグ付けの新しいプラスミドを示し、ヒトHCT116およびDLD1細胞のAID変異体の生成のための詳細なプロトコルを説明します。さらに、オスティル1阻害剤であるオーキシノールの使用を報告して、デグロン融合タンパク質の漏れの多い分解を抑制します。オーキシノールの添加は、デグロン融合タンパク質の枯渇後の迅速な再発現にも役立ちます。これらの改善は、生きたヒト細胞におけるタンパク質機能を研究するためのAID技術の有用性を高めます。

Controlling protein expression using a degron is advantageous because the protein of interest can be rapidly depleted in a reversible manner. We pioneered the development of the auxin-inducible degron (AID) technology by transplanting a plant-specific degradation pathway to non-plant cells. In human cells expressing an E3 ligase component, OsTIR1, it is possible to degrade a degron-fused protein with a half-life of 15-45 min in the presence of the phytohormone auxin. We reported previously the generation of human HCT116 mutants in which the C terminus of endogenous proteins was fused with the degron by CRISPR-Cas9-based knock-in. Here, we show new plasmids for N-terminal tagging and describe a detailed protocol for the generation of AID mutants of human HCT116 and DLD1 cells. Moreover, we report the use of an OsTIR1 inhibitor, auxinole, to suppress leaky degradation of degron-fused proteins. The addition of auxinole is also useful for rapid re-expression after depletion of degron-fused proteins. These improvements enhance the utility of AID technology for studying protein function in living human cells.