N末端ドメイン置換剤は、古細菌モノアシルグリセロールリパーゼをトリアシルグリセロールリパーゼに変化させます

背景：高熱性アルカエアの脂肪分解酵素は、一般に小さな炭素鎖脂肪酸エステル（C2-C12）を好み、エステラーゼに分類されます。しかし、いくつかは長鎖脂肪酸エステルで活性を示していますが、それらのどれも、Archaeglobus fulgidusの脂肪分解酵素AFLを除いて真のリパーゼとして分類されていません。したがって、私たちの主な目的は、古細菌のエステラーゼを工業用途向けの真のサーモスタブルリパーゼに設計することです。長鎖脂肪酸エステルを加水分解するリパーゼは、活性部位にある蓋ドメインによって媒介された界面活性化を示し、油水界面で立体構造を開くように切り替えます。蓋ドメインは、タンパク質工学と変異分析によって示された酵素活性、基質特異性、および安定性を調節します。ここでは、Archaeon Thermococcus onnurineus（strain Na1）からの特性化されていないモノアシルセルリパーゼ（TON-LPL）の工学を、61 N末端アミノ酸残基を118個のN末端アミノ酸残基を置き換えることにより、トリアシルグリセロールリパーゼ（RC-TGL）に報告します。熱性真菌のリパーゼ - サモミセスlanuginosus（TLIP）。 結果：TON-LPLおよびRC-TGLはクローン化され、大腸菌で過剰発現し、タンパク質は生化学研究のためにNI-NTAアフィニティクロマトグラフィーによって精製されました。両方の酵素は、さまざまなモノグリセリドを加水分解することができ、7.0の同じ最適pHを共有しました。ただし、RC-TGLは、最適温度（TOPT）で10°Cの大幅な減少を示しました。FAR UV-CDスペクトルは、両方のタンパク質のよく折りたたまれたα/β-ヒドラーゼ折りと一致していましたが、ゲルろ過クロマトグラフィーは、Trimer（Ton-LPL）からモノマー（RC-TGL）への四次構造の変化を明らかにしました。一見、RC-TGLのオリゴマー状態の違いは、温度最適の低下に関連している可能性があります。それにもかかわらず、RC-TGLはトリグリセリドとヒマシ油を加水分解しましたが、Ton-LPLはこれらの基質では活性ではありませんでした。 結論：ここでは、Ton-LPLの予測されたエステラーゼ活性を確認し、Ton-LPLで蓋エンジニアリングを実行し、その基質特異性をモノグリセリドからトリグリセリドに効果的に拡大しました。このアプローチは、N末端ドメイン置換を使用することにより、他の高血圧性エステラーゼを工業的に適切なリパーゼに設計する方法を提供します。RC-TGLの固定化された調製は、ヒマシ油で有意な活性を示しており、付加価値のある化学物質を取得するために、ヒマシ油バイオリーフィンに潜在的な用途があります。

BACKGROUND: Lipolytic enzymes of hyperthermophilic archaea generally prefer small carbon chain fatty acid esters (C2-C12) and are categorized as esterases. However, a few have shown activity with long-chain fatty acid esters, but none of them have been classified as a true lipase except a lipolytic enzyme AFL from Archaeglobus fulgidus. Thus, our main objective is to engineer an archaeal esterase into a true thermostable lipase for industrial applications. Lipases which hydrolyze long-chain fatty acid esters display an interfacial activation mediated by the lid domain which lies over active site and switches to open conformation at the oil-water interface. Lid domains modulate enzyme activities, substrate specificities, and stabilities which have been shown by protein engineering and mutational analyses. Here, we report engineering of an uncharacterized monoacylglycerol lipase (TON-LPL) from an archaeon Thermococcus onnurineus (strain NA1) into a triacylglycerol lipase (rc-TGL) by replacing its 61 N-terminus amino acid residues with 118 residues carrying lid domain of a thermophilic fungal lipase-Thermomyces lanuginosus (TLIP). RESULTS: TON-LPL and rc-TGL were cloned and overexpressed in E. coli, and the proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography for biochemical studies. Both enzymes were capable of hydrolyzing various monoglycerides and shared the same optimum pH of 7.0. However, rc-TGL showed a significant decrease of 10 °C in its optimum temperature (Topt). The far UV-CD spectrums were consistent with a well-folded α/β-hydrolase fold for both proteins, but gel filtration chromatography revealed a change in quaternary structure from trimer (TON-LPL) to monomer (rc-TGL). Seemingly, the difference in the oligomeric state of rc-TGL may be linked to a decrease in temperature optimum. Nonetheless, rc-TGL hydrolyzed triglycerides and castor oil, while TON-LPL was not active with these substrates. CONCLUSIONS: Here, we have confirmed the predicted esterase activity of TON-LPL and also performed the lid engineering on TON-LPL which effectively expanded its substrate specificity from monoglycerides to triglycerides. This approach provides a way to engineer other hyperthermophilic esterases into industrially suitable lipases by employing N-terminal domain replacement. The immobilized preparation of rc-TGL has shown significant activity with castor oil and has a potential application in castor oil biorefinery to obtain value-added chemicals.