レーザーからのRNA抽出の最適化は、ナノストリング分析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋マウス腎臓サンプルから微小放射性糸球体を捕獲しました

アーカイブ組織とその後のRNA分析からの特定の領域の微小化のための最適化されたプロトコルが必要ですが、RNAの分解と化学的修飾のために困難です。この研究の目的は、レーザーキャプチャマイクロディセクションおよびナノストリング遺伝子発現分析にマウスFFPE腎臓を利用するための最も適切なプロトコルを提示することでした。FFPEマウス腎臓からの糸球体および皮質尿細管サンプルからのマイクロディセクションとRNA抽出を最適化するために、異なる断面の厚さ（3、5、10μm）、2つのRNA抽出キット（QiagenおよびRoche）、および異なるH＆E染色方法を評価しました。RNAの品質と量は、ナノドロップとキビットを介して評価されました。最良の結果を提供するプロトコルは、5μmのセクション、H＆E染色のためのより短いプロトコル、RNAがRocheキットで抽出されたもので構成されていました。より高いナノストリング遺伝子カウントと低いQPCR CTは、Qubitで測定されたRNA濃度と有意に相関していましたが、ナノドロップで得られた測定値とは相関していませんでした。ナノストリングデータは、パネルに含まれる遺伝子はいずれも、腎臓全体と比較して皮質尿細管区画で差別的に発現していないことを示しました。しかし、腎臓全体と比較して、25の遺伝子が糸球体区画で差次的に発現しました。我々のデータは、アーカイブFFPE組織からマウス腎糸球体などの小さなコンパートメントから十分なRNAを抽出できること、および腎臓全体の分析全体が、腎臓全体のわずかな割合しか構成しない糸球体のトランスクリプトーム状態を正確に表していないことを示しました。

Optimized protocols for the microdissection of specific areas from archival tissues and the subsequent RNA analysis are needed but challenging due to RNA degradation and chemical modifications. The aim of this study was to present the most appropriate protocol for utilizing mouse FFPE kidney for laser capture microdissection and Nanostring gene expression analysis. We evaluated different section thicknesses (3, 5, 10 μm), 2 RNA extraction kits (Qiagen and Roche) and different H&E staining methods to optimize microdissection and RNA extraction from glomeruli and cortical tubules samples from FFPE mouse kidney. RNA quality and quantity were assessed via Nanodrop and Qubit. The protocol providing the best results consisted of 5 μm sections, a shorter protocol for H&E staining, and RNA extracted with the Roche kit. Higher Nanostring gene counts and lower qPCR cT significantly correlated with RNA concentrations measured with the Qubit, but not with measures obtained with the Nanodrop. The Nanostring data showed that none of the genes included in the panel was differentially expressed in the cortical tubule compartment compared to the whole kidney. However, 25 genes were differentially expressed in the glomerular compartment compared to the whole kidney. Our data showed that sufficient RNA can be extracted from small compartments like mouse renal glomeruli from archival FFPE tissue, and that whole kidney analysis does not accurately represent the transcriptome state of the glomeruli, which comprise only a small proportion of the overall kidney volume.