ヒトC3/COBRA毒因子ハイブリッドタンパク質を使用したCOBRA毒因子における機能的に重要なアミノ酸配列の同定

Cobra Venom Factor（CVF）は、Cobra Venomの補体活性化タンパク質です。CVFは、補体成分C3の構造的および機能的な類似体です。CVFは、C3Bと同様に、因子Bを備えたコンバーターゼを形成します。この二分子複合体CVF、BBはC3およびC5を切断する酵素です。ただし、CVF、BBは、C3B、BBとは有意に異なる機能特性を示しています。CVF、BBコンバーターゼは物理化学的に非常に安定しており、C3B、BBとは対照的に、HおよびIの因子による活性化に対して完全に耐性があり、C3およびC5の連続的な活性化を可能にし、血清の補完枯渇を可能にします。CVFとC3の機能的違いの構造的基礎を理解するために、CVFとヒトC3のいくつかのハイブリッドタンパク質を作成しました。ここでは、ヒトC3のC末端168アミノ酸残基をCVFからの対応する残基に置き換えると、CVFの機能特性を示すヒトC3誘導体であるハイブリッドタンパク質（HC3-1496）が生じることを報告します。この結果は、CVF特異的関数の重要な構造がCVFのC末端168アミノ酸残基内に存在することを示しています。さらに、HC3-1496の46C末端CVF残基をヒトC3配列に戻すと、残留補体枯渇活性のみを備えた物理化学的に不安定なコンバーターゼを示すハイブリッドタンパク質（HC3-1496/1617）が生じることを実証します。この結果は、CVF活性の構造的要件がすべてではないが、すべてではありませんが、46C末端アミノ酸残基内に存在することを示しています。また、ヒトC3（グルタミン酸）の酸性残基であるが、CVFの塩基性アミノ酸残基（ヒスチジン）である位置1633の潜在的な役割も調査しました。ただし、位置1633の電荷は機能的な関連性がないようです。ヒトC3（アスパラギン酸とリジン）のこれらの位置で2つの充電されたアミノ酸と1499および1501の位置でCVFに存在するニュートラルアミノ酸を交換すると、因子BとC3への結合の両方が著しく遅いカレクターゼ形成を示すハイブリッドタンパク質が得られました。切断は影響を受けなかったため、これらの2つの位置で帯電したアミノ酸残基がコンバーターゼの形成を妨げることを示しています。結論として、我々の研究は、ヒトC3とCVFのハイブリッドタンパク質が、CVFの機能的に重要なアミノ酸残基を特定するための貴重なツールを提示することを示しています。

Cobra venom factor (CVF) is the complement-activating protein in cobra venom. CVF is a structural and functional analog of complement component C3. CVF, like C3b, forms a convertase with factor B. This bimolecular complex CVF,Bb is an enzyme that cleaves C3 and C5. However, CVF,Bb exhibits significantly different functional properties from C3b,Bb. The CVF,Bb convertase is physico-chemically very stable, and completely resistant to an activation by Factors H and I. These two properties, in contrast to C3b,Bb, allow continuous activation of C3 and C5, and complement depletion in serum. In order to understand the structural basis for the functional differences between CVF and C3, we have created several hybrid proteins of CVF and human C3. Here we report that replacing the C-terminal 168 amino acid residues of human C3 with the corresponding residues from CVF results in a hybrid protein (HC3-1496) which is essentially a human C3 derivative exhibiting the functional properties of CVF. This result demonstrates that the important structures for the CVF-specific functions reside within the C-terminal 168 amino acid residues of CVF. We further demonstrate that reverting the 46 C-terminal CVF residues of HC3-1496 to human C3 sequence results in a hybrid protein (HC3-1496/1617) that exhibits a physico-chemically unstable convertase with only residual complement depleting activity. This result demonstrates that most, but not all, structural requirements for CVF activity reside within the 46 C-terminal amino acid residues. We also investigated the potential role of position 1633, which is an acidic residue in human C3 (glutamic acid) but a basic amino acid residue (histidine) in CVF. However, the charge at position 1633 appears to be of no functional relevance. Exchanging the neutral amino acids present in CVF at positions 1499 and 1501 with the two charged amino acids at these positions in human C3 (aspartic acid and lysine) resulted in a hybrid protein that exhibited significantly slower convertase formation although both binding to Factor B and C3 cleavage was not affected, demonstrating that the charged amino acid residues at these two positions interfere with the formation of the convertase. In conclusion, our work demonstrates that hybrid proteins of human C3 and CVF present valuable tools to identify functionally important amino acid residues in CVF.