Trizolベースの方法によるマイクロRNA分離と、貯蔵された血清およびcDNA誘導体のその安定性

マイクロRNA（miRNA）は、転写後レベルで遺伝子発現を調節する小さな非コードRNA分子です。miRNAの異常な発現は血液ベースのバイオマーカーの使用として提案されているため、miRNA分離の信頼できる技術と、さまざまな保存された条件でのmiRNAの安定性を調査する必要があります。この本研究の目的は、TRIZOLベースの分離技術の有効性と、貯蔵された血清およびcDNA誘導体におけるmiRNAの安定性を調査することを目的としています。miRNAを含む総RNAは、ヒト血清から分離され、miRNeasy®miniキットに対するTRIZOL®LS試薬分離法の効率の比較が実施されました。RNU6、miR-145、およびmiR-20Aの発現は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）によって決定されました。TRIZOL®LS分離により、MiRNeasy®MiniキットのRNA濃度が約35％低いことが示されました。両方の方法による孤立したRNAの純度は類似していた。RNU6、miR-145、およびmiR-20Aは室温で分解されましたが、すべての遺伝子は、血清およびcDNA貯蔵条件の両方で、72時間で4ºC、-20ºC、および-80ºCで安定していました。保存されたcDNA誘導体では、-20ºCで3か月間RNU6、miR-145、およびmiR-20Aの安定性を観察し、すべての遺伝子も-20ºCで4回の繰り返し凍結融解サイクルに抵抗しました。結論として、TRIZOLベースの方法は、循環miRNAの定量化に使用するのに効率的であり、経済的です。さらに、miRNA由来のcDNAの保存は、安定性効果を回避するための代替選択である可能性があることを提案しました。

MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNA molecules that regulate gene expression at the post-transcriptional level. Since aberrant expression of miRNAs has been proposed as usage for blood-based biomarkers, hence reliable techniques for miRNA isolation as well as stability of miRNAs in various stored conditions needs to be explored. This present study aimed to investigate the efficacy of the Trizol-based isolation technique and the stability of miRNAs in stored serum and cDNA derivatives. Total RNA, including miRNAs, was isolated from human serum and a comparison of the efficiency of the Trizol®LS reagent isolation method against the miRNeasy®mini kit was conducted. Expression of RNU6, miR-145, and miR-20a was determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). We showed that Trizol®LS isolation yielded significantly lower RNA concentrations than that of the miRNeasy®mini kit by approximately 35%. Purity of the isolated RNAs by both methods was similar. RNU6, miR-145, and miR-20a degraded at room temperature, but all genes were stable at 4ºC, -20ºC and -80ºC for a 72-hrs period, in both serum and cDNA storage conditions. In the stored cDNA derivatives, we observed the stability of RNU6, miR-145, and miR-20a for 3 months at -20ºC, and all genes also resisted 4 repeated freeze-thaw cycles at -20ºC. In conclusion, the Trizol-based method is efficient as well as economical to use for quantification of circulating miRNAs. In addition, we proposed that the storage of miRNA-derived cDNAs may be an alternative choice to avoid the stability effect.