ガラクトースはHepG2細胞のグルコースに変換できますか？薬物誘発性肝障害の評価のためのin vitroミトコンドリア毒性アッセイの改善

ヒト肝細胞癌細胞であるHepG2は、薬物媒介ミトコンドリア毒性評価によく使用されます。HEPG2培地中のグルコースは、ガラクトースに置き換えられて、細胞ATPの減少のための薬物IC50値の著しいシフトとしての薬物誘発ミトコンドリア毒性を明らかにします。ガラクトースは、Leloir経路での追加のATP消費需要によってHepG2ミトコンドリアを感作すると仮定されています。しかし、HepG2細胞と培地のNMRメタボロミクス分析は、非常に限られたガラクトース代謝を示しました。HEPG2細胞代謝におけるガラクトースの役割を明確にするために、U-13C6-ガラクトースまたはU-13C6-グルコースをHEPG2培地に加えて、これら2つの糖の代謝を特異的に追跡するのに役立ちました。HePG2細胞をU-13C6-ガラクトースとインキュベートした場合、U-13C3乳酸への変換はほとんど検出されませんでしたが、HEPG2細胞をU-13C6-グルコースとインキュベートした場合、U-13C3乳酸の豊富なU-13C3乳酸が生成されました。グルコースがない場合、HEPG2細胞は生体エネルギー源としてグルタミン消費を増加させました。追加のグルタミンの要件は、HEPG2細胞で同様のレベルの細胞ATPを維持するために必要なグルコースの量にほぼ一致しました。これにより、HEPG2細胞におけるガラクトースとグルタミン代謝の理解が改善されたのは、ATPベースのミトコンドリア毒性アッセイの最適化に役立ちました。修正されたアッセイは、ミトコンドリア毒性物質ではないという事前の証拠を持っている人からミトコンドリア毒性を引き起こすことが知られている正しく識別する化合物において、96％の感度と97％の特異性を示しました。修正されたアッセイの最大の重要性は、グルタミンが差し控えられたときのミトコンドリア脂肪酸β酸化（FAO）の阻害を検出する際の感度の向上でした。この改善されたアッセイを使用して、ヒトディリ（薬物誘発性肝障害）に対するミトコンドリア毒性の貢献度の可能性のある経験的予測が試みられました。55のディリ陰性化合物とともにDILIの多数のメカニズムを表す65のdili陽性化合物のテストによれば、ミトコンドリアメカニズム関連DILIの全体的な予測は25％の感度と95％の特異性を示しました。

Human hepatocellular carcinoma cells, HepG2, are often used for drug mediated mitochondrial toxicity assessments. Glucose in HepG2 culture media is replaced by galactose to reveal drug-induced mitochondrial toxicity as a marked shift of drug IC50 values for the reduction of cellular ATP. It has been postulated that galactose sensitizes HepG2 mitochondria by the additional ATP consumption demand in the Leloir pathway. However, our NMR metabolomics analysis of HepG2 cells and culture media showed very limited galactose metabolism. To clarify the role of galactose in HepG2 cellular metabolism, U-13C6-galactose or U-13C6-glucose was added to HepG2 culture media to help specifically track the metabolism of those two sugars. Conversion to U-13C3-lactate was hardly detected when HepG2 cells were incubated with U-13C6-galactose, while an abundance of U-13C3-lactate was produced when HepG2 cells were incubated with U-13C6-glucose. In the absence of glucose, HepG2 cells increased glutamine consumption as a bioenergetics source. The requirement of additional glutamine almost matched the amount of glucose needed to maintain a similar level of cellular ATP in HepG2 cells. This improved understanding of galactose and glutamine metabolism in HepG2 cells helped optimize the ATP-based mitochondrial toxicity assay. The modified assay showed 96% sensitivity and 97% specificity in correctly discriminating compounds known to cause mitochondrial toxicity from those with prior evidence of not being mitochondrial toxicants. The greatest significance of the modified assay was its improved sensitivity in detecting the inhibition of mitochondrial fatty acid β-oxidation (FAO) when glutamine was withheld. Use of this improved assay for an empirical prediction of the likely contribution of mitochondrial toxicity to human DILI (drug induced liver injury) was attempted. According to testing of 65 DILI positive compounds representing numerous mechanisms of DILI together with 55 DILI negative compounds, the overall prediction of mitochondrial mechanism-related DILI showed 25% sensitivity and 95% specificity.