CRISPR-CAS9を介した腸腫瘍オルガノイドのノックアウトは、結腸直腸癌ドライバー遺伝子の機能的検証を提供します

結腸直腸癌（CRC）は、世界中の癌関連の死亡の3番目の主要な原因です。いくつかのゲノムシーケンス研究により、包括的なCRCゲノムデータセットが提供されています。同様に、私たちの以前の研究では、マウスでゲノム全体の眠れる森の美女トランスポゾンベースの突然変異誘発スクリーニングを実施し、候補CRCドライバー遺伝子の包括的なデータセットを提供しました。ただし、ヒトとマウスの両方から一般的に特定されたほとんどの候補CRCドライバー遺伝子の機能的検証は実行されていません。ここでは、マウス腸腫瘍オルガノイドおよび異種移植マウスモデルのヒトCRC由来オルガノイドでCRISPR-CAS9を利用するCRCドライバー遺伝子を機能的に検証するためのプラットフォームについて説明します。2つの頻繁な遺伝子変異（APCおよびKRAS変異）を運ぶ遺伝的に定義された良性腫瘍由来オルガノイドを使用し、CRC発達の初期段階で作用したため、単一の遺伝子の変異の腫瘍形成能力を明確に評価できました。これらの研究は、ACVR1B、ACVR2A、およびARID2がCRCの腫瘍抑制遺伝子（TSG）として機能し、腫瘍転移におけるTRP53の役割を明らかにすることが示された。また、アクチビンおよび形質転換成長因子-β（TGF-β）の受容体の同時突然変異（TGF-β）が相乗的に腫瘍形成を促進し、CRCのアクチビン受容体の役割に光を当てることを示しました。この実験システムは、他の感作の突然変異や他の臓器に由来するオルガノイドを運ぶマウスの腸オルガノイドにも適用できます。これは、新しいがんドライバー遺伝子と新薬標的の同定にさらに寄与する可能性があります。

Colorectal cancer (CRC) is the third leading cause of cancer-related deaths worldwide. Several genome sequencing studies have provided comprehensive CRC genomic datasets. Likewise, in our previous study, we performed genome-wide Sleeping Beauty transposon-based mutagenesis screening in mice and provided comprehensive datasets of candidate CRC driver genes. However, functional validation for most candidate CRC driver genes, which were commonly identified from both human and mice, has not been performed. Here, we describe a platform for functionally validating CRC driver genes that utilizes CRISPR-Cas9 in mouse intestinal tumor organoids and human CRC-derived organoids in xenograft mouse models. We used genetically defined benign tumor-derived organoids carrying 2 frequent gene mutations (Apc and Kras mutations), which act in the early stage of CRC development, so that we could clearly evaluate the tumorigenic ability of the mutation in a single gene. These studies showed that Acvr1b, Acvr2a, and Arid2 could function as tumor suppressor genes (TSGs) in CRC and uncovered a role for Trp53 in tumor metastasis. We also showed that co-occurrent mutations in receptors for activin and transforming growth factor-β (TGF-β) synergistically promote tumorigenesis, and shed light on the role of activin receptors in CRC. This experimental system can also be applied to mouse intestinal organoids carrying other sensitizing mutations as well as organoids derived from other organs, which could further contribute to identification of novel cancer driver genes and new drug targets.