単鎖FV抗体の環化は、鎖間VH-VL相互作用によって媒介される特徴的な凝集を著しく抑制しました

シングルチェーンFV（SCFV）抗体は、重鎖（VH）と軽鎖（VL）の可変領域が短い柔軟なポリペプチドリンカーによって接続されている組換えタンパク質です。SCFVには、モノクローナル抗体と比較して、Escherichia coliを使用した簡単な遺伝子操作と低コストの生産の利点があり、したがって、次世代の医療抗体として利用されると予想されます。ただし、SCFVの実際の使用は、鎖間VH-VL相互作用によって媒介される凝集傾向によって引き起こされる均一性が低いために制限されています。抗体のVHドメインとVLドメイン間の相互作用は一般に弱いため、個々のSCFVは閉じた状態と開いた状態の間に平衡状態にあると想定されており、VHおよびVLドメインはそれぞれ組み立てられて分解されます。SCFVのこの動的な特徴は、鎖間VH-VL相互作用によって引き起こされる二量体、三量体、およびより大きな凝集体の形成をトリガーします。この問題を克服するために、n末端とC末端は、環状SCFVを生成するために、sortase a媒介ライゲーションによってここで接続されました。動的光散乱と高速原子間力顕微鏡分析から判断されたように、環状SCFVでは、閉鎖されたダイナミクスと凝集が著しく抑制されました。表面プラズモン共鳴および微分走査蛍光測定分析により、抗原に対する親和性も熱安定性もSCFV環化によって破壊されないことが明らかになりました。一般性は、現在の方法をいくつかのSCFVタンパク質に適用することで確認されました。これらの結果に基づいて、サイクリックSCFVは産業および治療用途で広く利用されると予想されます。

Single-chain Fv (scFv) antibodies are recombinant proteins in which the variable regions of the heavy chain (VH) and light chain (VL) are connected by a short flexible polypeptide linker. ScFvs have the advantages of easy genetic manipulation and low-cost production using Escherichia coli compared with monoclonal antibodies, and are thus expected to be utilized as next-generation medical antibodies. However, the practical use of scFvs has been limited due to low homogeneity caused by their aggregation propensity mediated by inter-chain VH-VL interactions. Because the interactions between the VH and VL domains of antibodies are generally weak, individual scFvs are assumed to be in equilibrium between a closed state and an open state, in which the VH and VL domains are assembled and disassembled, respectively. This dynamic feature of scFvs triggers the formation of dimer, trimer, and larger aggregates caused by the inter-chain VH-VL interactions. To overcome this problem, the N-terminus and C-terminus were herein connected by sortase A-mediated ligation to produce a cyclic scFv. Open-closed dynamics and aggregation were markedly suppressed in the cyclic scFv, as judged from dynamic light scattering and high-speed atomic force microscopy analyses. Surface plasmon resonance and differential scanning fluorometry analysis revealed that neither the affinity for antigen nor the thermal stability was disrupted by the scFv cyclization. Generality was confirmed by applying the present method to several scFv proteins. Based on these results, cyclic scFvs are expected to be widely utilized in industrial and therapeutic applications.