全長ヒトGRB7タンパク質とリン酸化代表変異体の特性評価

成長因子受容体結合タンパク質7（GRB7）タンパク質などの結合パートナーと組み合わせて、受容体チロシンキナーゼ（RTK）の二量体化状態は、細胞シグナル伝達調節において重要な役割を果たします。以前は、RTKの下流では、GRB7SH2ドメインチロシン残基のリン酸化状態がGRB7の二量体化を制御できることを提案し、GRB7のRTKに結合するGRB7の重要な調節ステップである可能性があります。この方法で、RTKを介したシグナル伝達経路で、追加の二量体化依存性調節が膜結合キナーゼの下流に発生する可能性があります。全長（FL）GRB7タンパク質への外挿、およびこの仮説をさらにテストする能力は、大量の純粋で安定したFLタンパク質の利用可能性によって妨げられています。ここでは、FL GRB7タンパク質の生物物理学的特性化と、チロシンリン酸化GRB7タンパク質型を表す変異体も報告します。サイズの除外クロマトグラフィーと分析的超遠心分離により、リン酸化 - チロシンミミックY492E-FL-GRB7タンパク質（Y492E-FL-GRB7）が、予想される生理学的濃度で本質的に単量体であることを示します。以前は、野生型FL GRB7（WT-FLGRB7）タンパク質が約11μMの解離定数（KD）を伴う二量体であることが示されています。ここでの私たちの研究では、約1μmで1桁以内のWT-FL-GRB7のFLタンパク質二量体化KDを測定します。WT-FL-GRB7のおおよそのサイズと形状は、チロシン - リン酸化を模倣したY492E-FL-GRB7タンパク質を模倣したものを、動的光散乱法によって決定しました。Grb7sh2ドメインのin vitroリン酸化は、利用可能なチロシン残基の1つのみがリン酸化されることを示しており、同じリン酸化パターンがFLタンパク質に関連する可能性があることを示唆しています。合計の生物物理学的特性評価は、機能的に活性なGRB7タンパク質の立体構造を理解するための観点から解釈されます。

It is well known the dimerization state of receptor tyrosine kinases (RTKs), in conjunction with binding partners such as the growth factor receptor bound protein 7 (Grb7) protein, plays an important role in cell signaling regulation. Previously, we proposed, downstream of RTKs, that the phosphorylation state of Grb7SH2 domain tyrosine residues could control Grb7 dimerization, and dimerization may be an important regulatory step in Grb7 binding to RTKs. In this manner, additional dimerization-dependent regulation could occur downstream of the membrane-bound kinase in RTK-mediated signaling pathways. Extrapolation to the full-length (FL) Grb7 protein, and the ability to test this hypothesis further, has been hampered by the availability of large quantities of pure and stable FL protein. Here, we report the biophysical characterization of the FL Grb7 protein and also a mutant representing a tyrosine-phosphorylated Grb7 protein form. Through size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation, we show the phosphorylated-tyrosine-mimic Y492E-FL-Grb7 protein (Y492E-FL-Grb7) is essentially monomeric at expected physiological concentrations. It has been shown previously the wild-type FL Grb7(WT-FLGrb7) protein is dimeric with a dissociation constant (Kd) of approximately 11μM. Our studies here measure a FL protein dimerization Kd of WT-FL-Grb7 within one order of magnitude at approximately 1μM. The approximate size and shape of the WT-FL-Grb7 in comparison the tyrosine-phosphorylation mimic Y492E-FL-Grb7 protein was determined by dynamic light scattering methods. In vitro phosphorylation of the Grb7SH2 domain indicates only one of the available tyrosine residues is phosphorylated, suggesting the same phosphorylation pattern could be relevant in the FL protein. The biophysical characterization studies in total are interpreted with a view towards understanding the functionally active Grb7 protein conformation.