RNAのフットプリントの識別：タンデム中のRNA免疫沈降を介したタンパク質複合体と続き（RIPIT-SEQ）

タンデム（RIPIT）のRNA免疫沈降は、RNA：タンパク質（RNP）複合体内のタンパク質のペアのRNAフットプリントを濃縮する方法です。Ripitは2つの精製手順を採用しています。第一に、タグ付きRNPサブユニットの免疫沈降の後に、軽度のRNase消化とその後の非変性親和性溶出が続きます。別のRNPサブユニットの2番目の免疫沈降により、定義された複合体の濃縮が可能になります。RNAとタンパク質の変性溶出に続いて、RNAフットプリントはハイスループットDNAシーケンスライブラリに変換されます。より人気のある紫外線（UV）架橋とは異なり、それに続くRBP結合部位を濃縮するための免疫沈降（CLIP）アプローチでは、RIPITはUV-Crosslinking Independentです。したがって、RNA相互作用に存在する多数のタンパク質にRIPITを適用できますが、RNAの調節に不可欠ですが、RNAまたはUVクロスリンクにRNAに直接接触しないでください。RIPITの2つの精製ステップは、目的のタンパク質が別の補因子と協力して作用する結合部位を特定するという追加の利点を提供します。二重精製戦略は、背景を制限することにより信号を強化するのにも役立ちます。ここでは、RIPITを実行し、孤立したRNAフットプリントからハイスループットシーケンスライブラリを生成するための段階的な手順を提供します。また、Ripitの利点とアプリケーションの概要を説明し、その制限のいくつかについて説明します。

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT's advantages and applications and discuss some of its limitations.