機能的蛍光顕微鏡イメージング：生細胞における高速動的プロセスの特性評価のための定量的スキャンの共焦点蛍光顕微鏡検査

スキャンせずに時間分解された（21μs/frame）共焦点蛍光顕微鏡顕微鏡顕微鏡顕微鏡顕微鏡イメージング技術である機能的蛍光顕微鏡イメージング（FFMI）は、溶液および生細胞における高速反応輸送プロセスの定量的特性評価のために開発されました。この方法は、非常に並列蛍光相関分光法（FCS）に基づいています。焦点面の複数のスポットでの蛍光分子の同時励起は、回折光学要素（DOE）を使用して達成されます。DOE生成された1024照明スポットからの蛍光は、32×32の単光子雪崩フォトダイオード（SPAD）を含む一致するマトリックス検出器によって共焦点配置で検出されます。グラフィック処理ユニット（GPU）を使用した並列信号処理によるデータ収集および高速自動相関および相互相関分析のためのソフトウェアにより、画像フレームのすべてのピクセルにわたって一時的な自己相関が可能になり、1次隣接と2次隣接と相互相関があります。45秒のピクセル。ここでは、単一分子感度を備えたこの定量的な時間分解イメージング法を紹介し、異なる細胞内コンパートメントの分子の濃度と翻訳拡散のライブセルの位置固有の違いにおけるマッピングの有用性を示しています。特に、特定の生物学的機能のない分子、たとえば、緑色蛍光タンパク質の増強（EGFP）が均一な拡散を示すことを示しています。対照的に、特殊な生物学的機能を実行し、分子標的に特異的に結合する分子は、濃度と拡散の位置固有の違いを示しています。ここでは、2つの転写因子分子、核移動の前後のグルココルチコイド受容体（GR）と性交櫛について例証されています。ショウジョウバエex vivoの唾液腺の還元（SCR）転写因子。

Functional fluorescence microscopy imaging (fFMI), a time-resolved (21 μs/frame) confocal fluorescence microscopy imaging technique without scanning, is developed for quantitative characterization of fast reaction-transport processes in solution and in live cells. The method is based on massively parallel fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Simultaneous excitation of fluorescent molecules in multiple spots in the focal plane is achieved using a diffractive optical element (DOE). Fluorescence from the DOE-generated 1024 illuminated spots is detected in a confocal arrangement by a matching matrix detector comprising 32 × 32 single-photon avalanche photodiodes (SPADs). Software for data acquisition and fast auto- and cross-correlation analysis by parallel signal processing using a graphic processing unit (GPU) allows temporal autocorrelation across all pixels in the image frame in 4 s and cross-correlation between first- and second-order neighbor pixels in 45 s. We present here this quantitative, time-resolved imaging method with single-molecule sensitivity and demonstrate its usefulness for mapping in live cell location-specific differences in the concentration and translational diffusion of molecules in different subcellular compartments. In particular, we show that molecules without a specific biological function, e.g., the enhanced green fluorescent protein (eGFP), exhibit uniform diffusion. In contrast, molecules that perform specialized biological functions and bind specifically to their molecular targets show location-specific differences in their concentration and diffusion, exemplified here for two transcription factor molecules, the glucocorticoid receptor (GR) before and after nuclear translocation and the Sex combs reduced (Scr) transcription factor in the salivary gland of Drosophila ex vivo.